华裔哈佛教授团队再发 NatureAI 驱动蛋白质重新设计拓展蛋白酶治疗应用范围刚刚华裔科学家、哈佛大学教授刘如谦David R. Liu团队再发 Nature。他们证明人工智能AI驱动的蛋白质重新设计结合实验室连续进化可以获得针对非天然靶点、同时具备高稳定性、高催化效率和高特异性的蛋白酶。论文链接https://www.nature.com/articles/s41586-026-10820-0具体而言他们先利用 AI 蛋白质设计模型 ProteinMPNN 对天然蛋白酶进行序列重设计获得稳定性更高且保持原有催化效率的蛋白酶变体。随后再以 AI 设计变体和对应天然蛋白酶为起点开展并行的噬菌体辅助连续进化PACE实验。结果显示基于 AI 设计的 BoNT/E 不仅保留了新底物特异性还提升了表达、稳定性和可进化性AI 重新设计后的蛋白酶不仅修复了 PTEN 靶向变体的稳定性损失还支持获得更高活性的新底物变体并进化出了高特异性的 ataxin - 2 靶向蛋白酶。这种“先设计稳定性再进化功能”的工作流对蛋白质科学具有广泛意义有望拓展蛋白酶治疗的应用范围成为蛋白质工程中的通用范式加速新酶、新型治疗蛋白以及其他功能蛋白的开发。AI 发现了新进化起点过去天然酶通常被直接作为定向进化起点但其本身稳定性有限经过人工改造或实验室定向进化获得的蛋白质常面临稳定性、催化活性或特异性不足的问题。不同于直接从天然酶开始做定向进化研究团队先通过计算设计获得更稳定、表达更高的 BoNT 蛋白酶再将这些设计蛋白酶作为自动化连续进化的起点筛选能够切割新底物的变体。具体流程如下1.计算设计获得稳定化 BoNT 蛋白酶研究团队以 BoNT/E 为模型使用 AI 模型 ProteinMPNN 重新设计蛋白酶序列保留底物识别和催化所需的关键残基其余位点由 AI 重新生成并用 AlphaFold2 评估结构。随后他们对 AI 设计变体进行表达、纯化和活性测试。结果显示多数 AI 设计变体能切割天然底物 SNAP25其中 D1、D2 和 D3 三个变体综合表现更优最高催化效率达到野生酶的 2.8 倍。为检验结果是否依赖 ProteinMPNN他们还用 PROSS 重新设计 BoNT/E也获得了表达、稳定性和酶动力学改善的变体。他们将这一流程拓展到其他 BoNT 蛋白酶包括 BoNT/F 和 BoNT/X结果同样保留或提高了催化效率。2.PACE 进化获得新底物切割能力获得稳定化变体后研究团队比较了 AI 设计变体 D3 与天然酶作为进化起点的适用性。他们先让两类起点分别适应三个越来越难切割的新底物 415、413 和 412并用 PACE 持续筛选更高活性的变体。结果显示AI 设计变体在三个新底物上都获得了更高活性且在最难底物 412 上成功率更高。突变互换实验还表明部分有益突变只在 AI 设计背景下有效不能直接用于天然酶。随后他们进一步尝试让 BoNT/E 切割 ataxin - 2。他们分别从天然酶和 AI 设计蛋白酶出发用 PACE 筛选 ataxin - 2 切割变体并通过酶学和细胞实验验证这些变体的活性与选择性。比“天然酶”更好整体来看基于 AI 设计的蛋白酶在保留新底物特异性的同时提高了表达水平、稳定性和可进化性。这一改造修复了 PTEN 靶向变体的稳定性损失也支持获得更高活性的新底物变体并进一步进化出高特异性的 ataxin - 2 靶向蛋白酶。具体结果如下1.改善已有进化蛋白酶AI 重新设计可以提高已有进化酶的表达和稳定性。此前PTEN 切割变体 E(4130)A2 表达低、稳定性差。于是研究团队把其中的进化突变移植到 AI 重新设计得到的 D1、D2 和 D3 中。结果显示新蛋白酶既保留了 PTEN 切割能力也没有重新切割原本的天然底物 SNAP25。同时新蛋白酶的表达水平明显提高移植后的 D1、D2 和 D3 变体在大肠杆菌中的表达量提高了 2.2 至 5.2 倍在 HEK293T 细胞中D2 和 D3 变体表达量提高超过 24 倍PTEN 切割产物分别增加 4.5 倍和 3.9 倍。2.提升新底物进化效果AI 设计起点在新底物进化中表现更好。研究团队比较了 D3 和天然 BoNT/E 在三个新底物 415、413 和 412 上的 PACE 进化结果。结果显示D3 更容易进化出高活性变体稳定化设计改善了后续进化效果。 D3 在最难底物 412 上优势最明显。天然酶四组实验中只有两组得到有效变体而 D3 四组全部成功D3 变体的 PACE 回路激活达到 16 至 20 倍高于天然酶变体约 10 倍。突变互换实验进一步显示部分有益突变只在 AI 设计蛋白酶中有效在天然酶中无法发挥同样作用。3.扩展蛋白酶进化空间重新设计起点能让蛋白酶获得不同于天然酶的突变组合。以底物 413 为例D3 在进化过程中富集了一些天然酶中少见的突变组合说明 AI 设计后的蛋白酶可以探索不同的功能序列空间。为评估其他设计蛋白酶是否也能作为有效进化起点研究团队进一步测试了两个替代重新设计起点ProteinMPNN 设计变体 D4 和 PROSS 设计变体 PROSS1。结果显示D4 和 PROSS1 均能在三个新底物上通过 PACE 选择并形成不同于天然酶和 D3 的进化基因型。 在这些替代起点中D4 的初始催化速度比天然酶低约 20 倍但进化后仍获得了与其他设计起点相当、甚至更高的活性。总体来看三种重新设计起点产生的进化变体活性均优于天然酶起点。4.进化 ataxin - 2 靶向蛋白酶序列重新设计起点产生了更快、特异性更强的 ataxin - 2 切割变体。研究团队通过 PACE 比较了天然酶起点和序列重新设计起点的进化结果。ataxin - 2 是一种与神经退行性疾病相关的蛋白BoNT/E 原本不会切割它。他们选择其 1181 - 1201 位残基作为新的切割区域这一区域与异常蛋白聚集有关。相比从天然酶出发得到的变体序列重新设计起点产生的 D3 进化变体切割 ataxin - 2 更快速度提高 1.4 - 1.7 倍同时它们没有检测到对天然底物 SNAP25 的切割。在 HEK293T 细胞中序列重新设计起点得到的变体表达更高产生的 ataxin - 2 切割产物更多副产物也更少。还有一些不足不过研究团队也指出该方法虽然有望推广到更多酶和蛋白功能但目前仍存在不足。具体如下首先这项研究主要围绕 BoNT/E 蛋白酶展开它更适合能够通过序列重新设计提高稳定性、并且功能可以在 PACE 中被选择的蛋白。类似优势能否出现在其他蛋白仍需要更多验证。其次ataxin - 2 靶向蛋白酶目前仍处于工具酶和早期应用验证阶段。他们表示这类设计进化酶可用于研究在蛋白水平上破坏致病性 ataxin - 2 包涵体是否能够改善神经退行性疾病相关表型仍有待后续研究推进。最后对于重新编程蛋白酶来说安全性仍是未来应用中的关键问题。尤其是在切割非天然靶标时除了提高目标切割效率未来还需要尽可能减少对天然底物的切割并系统评估潜在脱靶效应、细胞毒性、递送方式和免疫安全性。更多技术细节详见原论文。