【导语诺奖得主Jennifer Doudna团队在AI蛋白质设计领域取得重大突破于顶刊Science发表成果。他们创造出新型基因编辑蛋白SynTnpB部分变体活性超天然酶还揭示其结构不过该技术仍有不足待完善。】AI策略突破RNA引导核酸酶设计困境目前CRISPR - Cas技术虽能精准编辑DNA/RNA但设计自然界不存在且有活性的RNA引导核酸酶并非易事。现有序列模型生成的酶接近天然序列结构引导设计难在改写序列时保留活性。而Doudna团队提出结合结构与进化信息的AI蛋白设计策略选择小型RNA引导核酸酶TnpB作为设计对象。在设计模块先采用ESM逆折叠模型ESM - IF1根据TnpB三维结构生成候选序列同时基于进化信息构建序列掩码固定部分残基其余交由ESM - IF1重新设计。在筛选模块用细菌ccdB毒素系统筛选活性变体拆分测试TnpB的REC和NUC两个结构域发现NUC更耐受序列变化最终在1980个REC - NUC组合中筛出9个高活性、高多样性的变体。SynTnpB变体活性超越天然酶AI设计的SynTnpB变体在细菌、植物和人类细胞中表现出色甚至超越天然酶。在人类和植物细胞编辑实验中将9个变体放入HEK293T细胞和拟南芥原生质体验证在人类细胞中多数变体活性与野生型相当v1和v5表现最佳最高编辑率达到50%约为野生型的1.8倍在植物细胞实验中v1同样在多数测试靶点上优于野生型。从特异性和生化表征来看SynTnpB变体保留了典型TTGATTAM偏好但脱靶表现因变体而异。全基因组Tn5标签化分析显示v1的特异性与野生型相当v5和v7检测到更多脱靶位点。各变体表达水平与编辑活性不相关以v7变体为例其热稳定性与野生型相当保留较强靶链切割活性但切割反应较野生型有所减慢。冷冻电镜结构显示AI生成的残基在多个结构域与RNA - DNA形成新接触稳定不同构象状态下的界面。选择序列分化程度较高的v7进行解析其与野生型序列一致性为77%在RUNX1位点显示较高编辑效率冷冻电镜结构分辨率达到2.8 Å并捕获到TAM结合状态和R - loop形成状态两种构象其中TAM结合状态的构象中间体此前未在TnpB中观察到。技术不足与未来发展方向尽管该方法有望推广到更多RNA引导核酸酶及其他动态核酸结合蛋白但仍存在不足。在设计目标方面TnpB不同结构域对序列改变的耐受性不同DNA识别相关的REC结构域对替换更敏感未来需检验模块化设计原则是否适用于其他多结构域蛋白。在数据条件方面序列掩码依赖足够丰富的进化信息对数据库中序列的多样性和代表性要求较高更丰富、均衡的蛋白 - 核酸配对数据有助于方法推广。在机制理解方面AI生成残基如何影响核酸结合和构象变化仍需进一步研究此次冷冻电镜结构捕获到的TAM结合状态为未来研究RNA引导核酸酶的瞬时构象提供了先例。编辑观点诺奖团队的AI蛋白质设计成果意义重大SynTnpB变体展现出超越天然酶的潜力但技术仍有改进空间未来若能解决现存问题有望在基因编辑等领域带来更多突破。