一、写在前面文章Single-cell and spatial transcriptome analyses reveal tertiary lymphoid structures linked to tumour progression and immunotherapy response in nasopharyngeal carcinoma**IF16.6发布于《Nature Communications》。**TLS肿瘤中的“免疫堡垒”三级淋巴结构是肿瘤微环境中形成的异位淋巴组织是抗肿瘤免疫应答的关键策源地。它们通常包含B细胞区、T细胞区和支持性基质细胞但其在人类癌症中特别是在鼻咽癌中的精确细胞组成、空间关系和功能状态仍不清晰。鼻咽癌是一种与EB病毒密切相关的恶性肿瘤其特征之一是肿瘤内部存在大量的淋巴细胞浸润为研究TLS与肿瘤细胞的相互作用提供了理想的模型。本研究通过整合单细胞转录组、空间转录组及多重免疫荧光技术系统性地揭示了鼻咽癌中三级淋巴结构的细胞组成、空间架构、动态演化及其功能发现了一个由CXCL13 癌症相关成纤维细胞、B细胞和CXCL13 CD8 T细胞等构成的免疫激活微环境该微环境通过浆细胞介导的体液免疫清除EBV阳性肿瘤细胞并与更好的预后和免疫治疗响应相关。生信基地现在还推出了生信分析服务感兴趣的小伙伴可以滴滴客服[Biomamba_zhushou]详谈如果需要单细胞数据分析教学、生信热点全文复现、自测数据个性化分析辅导、实验科研服务和常态化实验学习欢迎联系客服[Biomamba_zhushou]。二、主要内容1绘制鼻咽癌TLS的单细胞与空间图谱通过对77个样本进行scRNA-seq鉴定了343,829个细胞包括B细胞、T细胞、髓系细胞和癌症相关成纤维细胞等。空间转录组分析进一步在组织原位确认了TLS的区域。发现了TLS的核心细胞群体B细胞谱系、滤泡辅助性T细胞、表达CXCL13的CD8 T细胞以及表达CXCL13的CAF在空间上验证了TLS中关键细胞类型的聚集。这些细胞在空间上共定位于TLS区域形成了潜在的相互作用网络。图1a-e通过多重免疫荧光和空间转录组特征评分直观展示了TLS中关键细胞群体的共存与空间分布。2生发中心反应随肿瘤进展而衰竭拟时序分析描绘了B细胞从初始B细胞→生发中心B细胞→浆细胞的发育轨迹。研究发现生发中心B细胞 的比例在晚期肿瘤中显著降低从早期中位值3.3%降至晚期1.0%。浆细胞的比例在不同阶段没有显著变化。从生发中心B细胞到浆细胞的克隆型转换显著减少。揭示了肿瘤进展过程中TLS内部的生发中心反应被抑制导致新生的、高亲和力的浆细胞减少体液免疫应答能力减弱。GC B细胞和抗体水平与患者更好的生存期显著相关。图2a-h通过发育轨迹、细胞比例、BCR克隆转换和生存分析完整地呈现了这一动态过程及其临床意义。3浆细胞诱导EBV肿瘤细胞凋亡并增强免疫治疗响应空间分析发现EBVhigh-TCA-wP 的凋亡信号是最高的在EBVhigh-TCA中有浆细胞浸润的凋亡信号显著高于没有浆细胞浸润的。在EBVhigh-TCA区域可以看到CASP3的凋亡肿瘤细胞被IgG浆细胞、CD56 NK细胞和CD68巨噬细胞所包围。在EBVhigh-TCA区域与浆细胞紧密相邻的凋亡肿瘤细胞数量显著多于 EBVlow-TCA区域。这强烈表明浆细胞的存在能够特异性地促进EBV高感染恶性细胞的凋亡浆细胞与EBV高载量的肿瘤细胞在空间上紧密相邻。在接受PD-1抑制剂治疗的患者的肿瘤细胞中浆细胞浸润的位点更多、免疫球蛋白的转录水平更高、EBVhigh-TCA-wP 的比例显著更高。TLS中产生的浆细胞分泌抗体通过抗体依赖性细胞毒性ADCC和吞噬作用ADCP等方式近距离清除EBV感染的肿瘤细胞。应答者的肿瘤内具有更高的浆细胞浸润和肿瘤凋亡水平。因此浆细胞的空间分布和功能状态可以作为预测免疫治疗疗效的强大生物标志物。图3a-e和图4a-c通过空间共定位、凋亡特征分析和治疗响应队列比较强有力地支持了这一机制。4CXCL13 CAF是TLS的功能性组织者鉴定出一个独特的CAF亚群其高表达CXCL13、CCL19等趋化因子以及VCAM1等黏附分子iCAF_C2_CXCL13的比例从早期到晚期NPC呈现下降趋势在TLS的B细胞区CXCL13 CAFs 与 CXCR5 B细胞紧密地共存B细胞对VCAM1 CAFs的粘附能力显著更强这种增强的粘附可被VCAM1中和抗体所阻断因此CXCL13 CAFs通过VCAM1分子直接介导了B细胞在TLS中的滞留CXCL13过表达显著促进了B细胞的迁移这种促进作用可被CXCL13中和抗体所阻断CXCL13 CAFs通过CXCL13-CXCR5轴主动招募B细胞至TLS与VCAM1 CAFs共培养的B细胞其IgG产量显著更高。CXCL13 CAFs不仅能招募和滞留B细胞还能直接促进其分化为抗体分泌细胞。成纤维细胞过表达TNFSF13B能显著提升共培养体系中B细胞的IgG产量这种提升可被TNFSF13B中和抗体完全逆转。因此CXCL13 CAFs通过TNFSF13B信号通路来直接调控B细胞的成熟和抗体生产。功能实验证明这类CAF通过CXCL13-CXCR5轴介导B细胞趋化通过VCAM1-整合素轴介导B细胞黏附并通过TNFSF13B信号促进B细胞产生IgG抗体从而在TLS的形成和功能维持中发挥核心组织者作用。图5a-f和图6a-d通过基因表达、相互作用分析以及共培养实验验证了CXCL13 CAF的功能。5CXCL13 CD8 T细胞是效应T细胞的前体库发现一群定位于TLS的CD8 T细胞表达CXCL13和干细胞样基因具有较低的耗竭特征这在TLS中存在 CD8CXCL13PD1TIM3- 的T细胞它们环绕在CD20 B细胞周围伪时间轨迹分析显示CD8 T细胞从多个起源状态包括 CD8_C8_CXCL13出发最终汇聚到终末耗竭状态 CD8_C11_HAVCR2沿着从CD8_C8_CXCL13到CD8_C11_HAVCR2的伪时间轴耗竭评分逐渐升高并且干细胞样评分逐渐下降证明TLS中的CD8_C8_CXCL13细胞是肿瘤内耗竭CD8 T细胞的重要前体来源群干细胞样T细胞是肿瘤内耗竭T细胞的前体它们从TLS迁移至肿瘤巢并逐渐耗竭。它们与B细胞和肿瘤细胞存在广泛的相互作用是具有抗肿瘤潜力的关键细胞亚群。图7a-g展示了该细胞亚群的转录特征、发育轨迹和空间分布。三、总结与展望** 1. 文章结论**本研究构建了鼻咽癌TLS的高分辨率细胞与空间图谱阐明了一个核心生物学过程CXCL13 CAF和B细胞等构成的TLS微环境支持了生发中心反应和浆细胞分化进而通过局部抗体反应清除EBV肿瘤细胞同时TLS也是干细胞样CD8 T细胞的摇篮为持续的T细胞免疫提供补给。 这一免疫激活微环境最终抑制肿瘤进展并增强免疫治疗疗效。2. 研究意义深化了对TLS在人类癌症中特别是在病毒相关癌症中组成与功能的认知将体液免疫和细胞免疫在空间上联系起来。提示了通过靶向诱导TLS形成如激活CXCL13 CAF、扩增CXCL13 CD8 T细胞或联合使用EBV特异性抗体可能成为治疗鼻咽癌等EBV相关肿瘤的新方向。3.创新意义首次在NPC中系统整合单细胞与空间转录组数据揭示TLS的异质性与功能发现CXCL13 CAFs和CXCL13 CD8 T细胞等新型TLS相关细胞群体提出“TLS–浆细胞–EBV肿瘤细胞”空间互作模型阐明局部免疫清除机制建立TLS特征评分TLS-CS具有预后与疗效预测价值。4.运用的技术手段与方法10x Genomics单细胞RNA测序scRNA-seq空间转录组学Stereo-seq, VisiumSeurat、Harmony、Monocle3等生物信息学分析流程拟时序分析Diffusion Map, PCA-based trajectory细胞通讯分析CellChat, CSOmap多重免疫组化/免疫荧光mIHC/IFBCR/TCR克隆分析Cell Ranger, Shazam, STARTRAC基因集富集分析GSEA, GSVA体外共培养与功能验证迁移、黏附、抗体产生