大鼠睾丸支持细胞SEC的原代分离与鉴定一、简介①睾丸组织中的细胞包括支持细胞、间质细胞和生精细胞。睾丸支持细胞在精子发生和成熟过程中起着重要作用具有支持、保护和营养生精细胞作用促雄激素结合蛋白(Androgen binding proteinABP) 合成ABP 可与雄激素结合以保持生精小管内雄激素的水平促进精子发生。支持细胞与干细胞体外共同培养能促进干细胞的生长可能与支持细胞能够分泌多种促细胞生长物质有关② 体外培养分离的支持细胞形态支持细胞呈椭圆形并长出多个突起核仁和胞质内有颗粒物质。支持细胞经HE 染色后呈不规则形状或辐射状有多个粗大的突起。细胞核染成深色细胞质丰富染成淡红色油红O 染色后细胞核染成蓝色。细胞质中有许多被染成红色的大小不一圆形细胞脂质小滴Feulgen染色后细胞质未着色细胞核淡染为紫红色其内可见一个至数个着色较深的紫红色颗粒即为核仁周围的卫星小体。胰蛋白酶-胶原酶混合消化法二、材料1、实验动物2-3周龄15-21天左右的SD大鼠雄性2、组织来源睾丸3、手术器材手术剪镊、解剖镊、眼科剪镊4、消化酶Ⅳ型胶原酶sigmaCat#: C5138, 0.25%胰酶翊圣Cat#: 40101ES255、培养基 DMEM/F1215%FBS1%双抗三、实验步骤1. 取15-21的雄性SD大鼠采用颈椎脱臼法处死全身于75酒精中浸泡3-5min。2. 无菌操作取睾丸并置于预先加入2%双抗的无菌PBS的培养皿中用PBS清洗2次去掉睾丸表面黏液和血液用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管。3. 将踢除干净的睾丸实质转移至另一个培养皿中加入3-5ml PBS用眼科剪将睾丸实质剪碎大约为1 mm³的碎块静置3min-5min用移液枪将上清液弃去目的是去除间质细胞。4. 将睾丸实质碎块转移至15ml的离心管中加入相当于离心管中睾丸实质倍体积的0.25%胰酶5ml轻轻震荡使睾丸实质中的曲精小管散开37℃水浴中消化5-10min期间每隔2min震荡一次观察组织碎块消化成线索状加入等体积的完全培养基终止消化1000rpm离心5min弃上清液再加5ml的PBS用移液枪轻轻吹打悬浮细胞1000rpm离心5min弃上清液。上清液可再次离心收集细胞铺6孔板5. 加入相当于离心管中睾丸实质倍体积的0.1的Ⅳ型胶原酶(5ml)37℃水浴消化10min每隔2min震荡一次观察组织变成黏液状镜下可完成大量的细胞爬出再加入等体积的完成培养基终止消化经100目网筛过滤收集细胞滤液800rpm离心5min弃上清液加入含15%FBS的DMEM/F12完全培养基重悬接种于T25培养瓶大概可铺5个T25培养瓶放入培养箱中进行培养24小时。6. 24h后取出培养瓶弃掉培养液用PBS清洗次。用20mmol/LPH7.4的Tris-Hcl低渗处理2-5 min去除精原细胞。再用PBS或者培养基洗2次加含15FBS 的DMEM/F12 培养基继续培养。7.每隔24 h观察细胞生长状态每隔48 h 换培养液一次待细胞长满至80%以上可进行传代。四、各阶段的大鼠睾丸支持细胞照片白光图1 消化过程中可见生精小管周围有大量的细胞100X图2 消化完成并过筛后得到的细胞100X图3 原代培养24小时的大鼠睾丸支持细胞100X图4 原代培养48小时的大鼠睾丸支持细胞100X图5 传代后的大鼠睾丸支持细胞100X图6 传代后的大鼠睾丸支持细胞200X五、大鼠睾丸支持细胞的鉴定常用鉴定方法①HE染色观察细胞的形态和双核结构睾丸支持细胞是双核的②油红O染色③甲基绿派洛宁染色④Feulgen染色主要用来检测细胞核中的卫星核小体⑤Vimentin、ABP免疫荧光鉴定图. 云克隆大鼠睾丸支持细胞免疫荧光鉴定图Vimentin抗体云克隆深耕原代细胞领域近二十年公司持有实验动物生产、使用许可证及动物防疫条件合格证并整体通过ISO 9001与ISO 13485质量体系认证。武汉云克隆依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠兔犬猫山羊豚鼠等540多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务。