基于TR-FRET技术的PROTAC三元复合物检测原理。蛋白降解靶向嵌合体通过其双功能分子结构同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶复合物中的底物识别亚基诱导形成三元复合物进而触发目标蛋白的泛素化修饰与蛋白酶体途径降解。该作用机制有别于传统小分子抑制剂的二元结合模式使PROTAC的效能评估高度依赖于对三元复合物形成的直接检测。时间分辨荧光共振能量转移技术凭借其均相、免洗和高灵敏度的特点已成为研究PROTAC介导的靶蛋白-E3连接酶相互作用的优选方法。该技术的核心在于利用长寿命荧光供体如铕或铽的络合物与合适受体分子之间的能量转移。当供体与受体因生物分子间特异性结合而靠近至纳米级距离时供体受激后可通过非辐射方式将能量转移给受体使其发射出特征性长寿命荧光。通过时间分辨检测模式延迟读取信号可有效消除背景荧光的干扰从而提高检测的信噪比和特异性。人源CDK6/CRBN PROTAC结合检测试剂盒的组分设计与反应体系。针对细胞周期蛋白依赖性激酶6与CRBN介导的PROTAC活性评估优爱生物提供专门的UniOne® TR-FRET Human CDK6/CRBN PROTAC Binding Kit。该试剂盒的设计借鉴了已验证的TR-FRET PROTAC检测策略即通过标记抗体分别识别带有不同标签的靶蛋白和E3连接酶组分在PROTAC分子存在时形成供体-靶蛋白-PROTAC-E3连接酶-受体复合物。在此体系中供体荧光基团通常与识别CDK6标签如His标签的抗体偶联而受体荧光基团则与识别CRBN标签如FLAG标签的抗体偶联。当CDK6、PROTAC分子和CRBN三者结合形成三元复合物时供体与受体被拉近从而产生可量化的TR-FRET信号。该信号强度与三元复合物的形成量呈正相关是评估PROTAC分子结合活性的直接依据。此外该试剂盒也可能采用荧光标记的已知配体竞争结合模式通过监测信号下降来评估待测PROTAC或配体与CRBN的结合能力。反应在微孔板中进行操作流程简便仅需将试剂与待测样品混合孵育后即可读数无需复杂的分离洗涤步骤。CDK6与CRBN作为PROTAC靶点的生物学意义。CDK6属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族与细胞周期蛋白D3结合后调控细胞周期从G1期向S期的进程其功能异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。CRBN是CUL4-RBX1-DDB1 E3泛素连接酶复合物的底物识别受体能够招募并介导多种蛋白质的泛素化降解。由于CRBN可被免疫调节剂类药物如来那度胺结合它已成为PROTAC技术中应用最广泛的E3连接酶之一。靶向CDK6的PROTAC分子能够同时结合CDK6和CRBN利用CRBN的E3连接酶活性诱导CDK6蛋白的选择性降解为癌症治疗提供了超越传统激酶抑制剂的潜在策略。试剂盒的应用场景与性能验证。UniOne® TR-FRET Human CDK6/CRBN PROTAC Binding Kit主要应用于PROTAC分子的高通量筛选与构效关系研究。通过检测不同浓度PROTAC诱导形成的三元复合物可绘制典型的钟形剂量-反应曲线其峰值对应的浓度即为PROTAC实现最大效能的浓度该参数常用于不同PROTAC分子的活性排序和优选。该试剂盒也可用于评估待测化合物对CDK6或CRBN配体结合位点的竞争性抑制活性。性能验证实验通常包括阳性对照如已知活性的PROTAC分子例如BSJ-03-204诱导的剂量依赖性信号升高、阴性对照如非PROTAC配体无显著信号响应以及竞争性实验证明信号的特异性。