慢病毒载体伯远慢病毒载体-伯远生物

慢病毒载体伯远慢病毒载体伯远生物是国家级专精特新小巨人企业国家级重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上作为功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含协和、同济、华西、湘雅、中山、军事医学院等顶尖医学研究机构各类仪器设备投资超1个亿案例展示案例展示1、慢病毒感染细胞效率实例图 慢病毒感染细胞效率2、慢病毒体内表达应用实例图 慢病毒体内表达应用实例Shi Y, et al. 2017。参考文献Mátrai J, Chuah MK, VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications.Mol Ther. 2010;18(3):477-490.Shi Y, Ping YF, Zhou W, et al. Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.Nat Commun.2017;8:15080.我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达慢病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联背景说明背景说明通常LVs是通过反式互补产生的其表达系统由用于表达特定基因的目的质粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等组分的包装质粒组成其中包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。LVs具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点区别于一般的逆转录病毒载体其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。携带有外源基因的LVs在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒通过感染细胞或活体组织实现外源基因在细胞或活体组织中表达。通常根据不同的实验目的针对LVs改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入LVs以进行表达。图 反式互补生产LVsMátrai et al. 2010。原理简介携带有外源基因的LVs在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒通过感染细胞或活体组织实现外源基因在细胞或活体组织中表达。LVs包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞在细胞中进行病毒的包装包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中离心取得上清液后可直接用于宿主细胞的感染目的基因进入到宿主细胞之后经过反转录整合到基因组从而高水平的表达效应分子。通常根据不同的实验目的针对LVs改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入LVs以进行表达。图 慢病毒包装和侵染过程示意图我司载体简介我司可提供丰富的LVs产品体系用于操作编码基因和非编码基因如lncRNA、miRNA、circRNA。我司原始细胞慢病毒包装载体列表可根据不同的需求选择不同的载体插入不同的位置服务流程服务流程客户在线下单——订单/实验材料确认——构建LVs包装载体与目的载体——共转染293T细胞——病毒上清收集——病毒浓缩和纯化——慢病毒鉴定包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等——可选后续感染目的细胞及相关实验我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达慢病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联服务内容及说明服务内容及说明慢病毒滴度鉴定方法检测项目原理优点缺点GEP荧光计数流式细胞计数经典方法重复性好检测活性病毒感染滴度仪器和操作要求高操作复杂绝对定量qPCR病毒感染工具细胞后抽提整合目的片段的细胞基因组DNA与标准品比较检测活性病毒感染滴度最接近真实滴度仪器和操作要求高操作复杂RT-qPCR病毒梯度稀释感染工具细胞后抽提RNART-qPCR检测病毒基因组表达检测活性病毒感染滴度受限于病毒感染后检测基因表达丰度p24核心蛋白ELISA定量对慢病毒颗粒稳定表达的p24蛋白进行ELISA检测简单、快捷、重复性好反映的是病毒物理颗粒数不是活性滴度适用范围现在LV系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、miRNA研究以及活体动物实验中。客户下单及项目信息填写在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录请客户按照页面提示填写目的基因信息、载体构建详情后续感染的细胞可选自行提供或我司提供。实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户并发送实验报告查看网址。实验结题后实验报告、检测结果可在线查看或打印并永久保留。实验周期致电详询实验交付内容1、所有实验的原始数据包括实验过程、实验试剂与设备等2、重组载体的全序列信息和注释信息3、重组载体的酶切图谱4、重组载体测序结果5、引物序列6、病毒质控鉴定报告与结果分析包含滴度鉴定、BCA检测、支原体检测等可选7、高滴度慢病毒载体不低于108TU/mL8、阴性对照病毒9、稳转细胞株可选。慢过表达载体的详细设计方案我按“目标定义→载体骨架→表达盒设计→标签与筛选→特殊蛋白处理→验证策略”来整理尽量写成你可以直接拿去做方案设计的版本。1.先定目标慢病毒载体过表达载体设计的第一步不是选骨架而是先明确你想回答什么问题。如果是做功能研究通常关注的是蛋白是否能正常表达、定位、互作和发挥生物学作用而不只是“有没有条带”。慢病毒载体如果是做稳定细胞系还要考虑长期表达是否会对细胞有毒性、是否需要筛选标记、是否需要后续单克隆化。2.选载体骨架慢病毒载体一般优先选择成熟的哺乳动物表达载体或慢病毒过表达载体。如果你想先快速摸底表达瞬时表达载体更简单如果你后面还要做稳定株、长周期表型或rescue慢病毒载体更实用。骨架本身最好是实验室常用、元件清楚、文献和操作经验较多的版本避免一开始就用过于复杂的定制骨架。3.表达盒怎么设计过表达载体的核心表达盒通常是启动子→Kozak→目的基因CDS→标签/连接肽→polyA信号。如果你做的是功能研究最好克制地加入元件不要把表达盒堆得太复杂因为每多一个元件都可能带来表达下降或功能干扰。目的基因建议优先克隆CDS而不是基因组片段这样更利于表达也更容易控制阅读框。4.启动子怎么选启动子决定表达强度和细胞适配性。CMV强适合多数细胞的瞬时高表达。EF1α更稳某些细胞里比CMV更不容易沉默。CAG也常用于高表达场景尤其在部分真核体系里表现很好。如果你做的是功能研究我一般建议先从CMV或EF1α开始必要时做平行比较。5.标签怎么设计标签的选择要看你是更重视检测方便还是更重视功能不受影响。如果是功能研究通常优先选小标签比如FLAG、HA、Myc或His因为它们对蛋白本身影响相对小也方便WB、IF、IP。如果你后面还想纯化蛋白His-tag最省事如果你要做互作和免疫沉淀FLAG/HA往往更顺手。大标签如GST、MBP更适合解决表达和可溶性问题但功能研究时最好做可切除版本避免标签本身改变蛋白行为。6.标签放哪边慢病毒载体N端还是C端不能一概而论。慢病毒载体慢病毒载体如果蛋白N端有信号肽、定位序列、功能核心、酶活位点或磷酸化位点标签一般尽量放C端反过来如果C端更重要就考虑N端。最稳妥的做法是先做一个N端版和一个C端版至少比较表达和表型避免一开始就把关键功能区挡住。7.筛选标记怎么选如果你要做稳定表达筛选标记很重要。最常见的是Puro其次是Neo、Hygro、Bsd。如果只是瞬时表达筛选标记不是必须但如果你后续要做稳定细胞系或长期机制研究建议一开始就把筛选标记设计进去。慢病毒载体8.对特殊蛋白的处理分泌蛋白分泌蛋白通常要考虑信号肽。如果蛋白天然信号肽明确、分泌正常最好保留如果表达效率差再考虑换成更成熟的异源信号肽。慢病毒载体膜蛋白膜蛋白要特别注意跨膜区和胞内尾部。有时候不是“全长表达”最好而是表达更适合功能研究的结构域版本比如去掉跨膜区、保留胞内结构域或胞外结构域。大蛋白或难折叠蛋白如果蛋白特别难表达先考虑可溶性和折叠再谈功能。这时可以先用SUMO、GST、MBP这类融合标签摸底但最终做功能验证时最好保留一个去标签或小标签版本。9.是否加报告基因GFP、mCherry这类报告基因可以帮助看转染效率和定位但它们会明显增加载体长度也可能干扰功能。所以我的建议是先期摸底可以加。慢病毒载体正式功能实验尽量用小标签替代荧光大标签除非你确实需要实时成像。10.构建后的验证流程过表达载体构建好后不要只看测序对不对还要看表达是否真正符合预期。建议至少做三层验证测序确认确保阅读框正确、无突变。mRNA表达qPCR看是否转录成功。蛋白表达WB、IF、流式或免疫沉淀看是否表达且定位正确。如果是功能研究最好再加一个表型或通路读出否则“表达上去了”不等于“功能成立”。11.一个实用的推荐模板如果你现在没有特别复杂的限制我会推荐你用这个思路起步骨架成熟哺乳动物表达载体或慢病毒过表达载体。启动子CMV或EF1α。标签C端FLAG/HA/Myc。筛选Puro。特殊蛋白按需保留信号肽或做结构域截短。验证测序qPCRWB功能表型。12.你做功能研究时的核心原则一句话概括就是先保证表达再尽量减少标签和载体对功能的干扰最后用功能读出来证明生物学意义。如果你一开始就把载体做得太复杂后面很难判断表型到底来自蛋白本身还是构建策略本身。