兔角膜上皮细胞Corneal Epithelial Cells ,CEC的分离一、简介角膜是由角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层组成角膜上皮层Epithelial cell是由非角化的鳞状上皮构成的共有5-7层细胞厚约50-70um是角膜的第一道屏障可以有效阻止水分的散失和外界病原体的入侵。角膜上皮层与机体其它部位的上皮结构不同在组织结构上由三种细胞组成有由外到内依次为鳞状上皮细胞翼状细胞和柱状细胞。柱状细胞是角膜上皮层中唯一具有分裂能力的细胞向上分化产生翼状细胞并最终分化产生鳞状上皮细胞向下分化产生基底膜使上皮层和前弹力层紧密结合。二、材料1、实验动物6月龄的新西兰大白兔1只雌雄不限2、组织来源眼球3、手术器材手术剪镊、解剖镊、眼科剪镊、手术刀、体式显微镜4、消化酶Dispase II分散酶、0.25%胰酶5、培养基DMEM/F1210%FBS1%双抗10ng/ml EGF①DMEM/F12GibcoCat#: 51500056②EGFCloud-Clone Corp.Cat#: APA560Hu01三、实验步骤1. 空气栓塞法处死新西兰大白兔。2. 75%酒精消毒眼部周围组织无菌条件下取去眼组织用PBS2%双抗缓冲液浸洗3次。3. 去除眼组织周边的筋膜和脂肪用手术刀沿角膜边缘环切下角膜。4. PBS清洗后加入0.1%的dispase II分散酶4℃过夜处理16-18h。5. 用移液枪轻轻吹吸角膜表面上皮细胞层待角膜表面组织脱落后移去角膜组织收集含有上皮细胞层的消化液800rpm离心5min。6. 弃上清加入0.25%的胰酶37℃消化10min。7. 用完全培养基终止消化移液器轻轻吹打1000rpm离心5min。8. 离心结束后去除上清用DMEM/F12完全培养基重悬制成细胞悬液接种。9. 3d后观察并换液处理。四、实验过程图片五、各阶段兔角膜上皮细胞图片兔角膜上皮细胞荧光鉴定鉴定方法ZO-1特异性抗体免疫荧光鉴定Figure 7 Immunofluorescence identification of ZO-1 specific antibody (×200)Figure 8 Immunofluorescence identification of ZO-1 specific antibody (×400)此protocol适用于犬,羊,猫等物种