在新药研发、天然产物活性研究以及化学生物学领域准确识别药物直接作用的蛋白靶点始终是研究重点。传统靶点筛选方法大多依赖化学探针或亲和标记但探针修饰可能影响药物天然结构及结合活性导致实验结果与真实生理状态存在偏差。随着非标记Label-free技术的发展DARTSDrug Affinity Responsive Target Stability药物亲和响应靶点稳定性因无需修饰药物即可完成靶点筛选逐渐成为药物作用机制研究的重要技术手段。DARTS技术概述DARTS技术最早由Lomenick团队于2008年提出并发表于《美国国家科学院院刊》PNAS。该方法利用药物结合后蛋白稳定性发生变化这一特性在保持药物天然结构的基础上完成候选靶点筛选。相比传统依赖探针设计的技术路线DARTS无需任何化学标记可直接使用原型药物进行实验因此能够有效降低探针修饰带来的实验偏差更真实地反映药物与蛋白之间的天然相互作用。目前该技术已广泛应用于天然产物、小分子化合物、中药复方、复杂组织裂解液及老药新用等多个研究方向。DARTS技术原理DARTS的核心思想来源于蛋白稳定性变化。在没有药物结合时蛋白质保持原有空间构象大量酶切位点暴露于蛋白酶环境中因此容易被Pronase等广谱蛋白酶逐步降解。当药物与目标蛋白结合后蛋白空间结构发生一定程度调整部分酶切位点受到遮挡整体热力学稳定性发生改变使蛋白对蛋白酶具有更高耐受能力。经过限制性酶解后大部分未结合药物的蛋白已被降解而真正结合药物的蛋白则能够保留完整蛋白或较大的蛋白片段。研究人员再利用Western BlotWB或高分辨率质谱MS分析这些保留下来的蛋白即可筛选出候选靶点。由于整个实验过程中无需对药物进行修饰因此更接近药物真实作用状态。DARTS技术优势DARTS能够成为目前应用最广泛的非标记药物靶点发现技术之一与其自身特点密切相关。首先无需构建化学探针可避免药物结构发生改变提高实验结果真实性。其次实验直接在细胞或组织裂解液中开展能够较好保持蛋白天然构象及微环境使药物结合更加接近体内真实情况。此外DARTS适用于天然产物、人工合成小分子、中药复方以及不同来源生物样本具有较强的样本兼容能力。由于实验流程相对规范无需特殊探针开发因此整体实验成本较低也更容易建立标准化实验体系。DARTS实验流程完整的DARTS实验一般包括蛋白裂解、药物孵育、限制性酶解以及蛋白检测几个步骤。首先需要制备蛋白裂解液。通常要求蛋白总量不少于3 mg对于类器官等复杂样本建议达到5 mg以上以保证后续检测覆盖率。裂解液推荐采用温和型IP裂解液如Beyotime P0013J不建议使用RIPA等强变性裂解液以避免天然蛋白构象受到破坏。随后加入药物进行孵育。实验通常推荐药物终浓度为100 μM。由于实验发生于裂解液体系不存在细胞毒性影响因此较高浓度能够提高靶蛋白占据率。Martinez Molina于2013年的研究也支持这一实验策略。药物孵育完成后加入Pronase进行限制性蛋白酶消化。需要注意的是裂解过程中加入的蛋白酶抑制剂通常无需去除因为正式实验前已通过梯度实验确定最佳Pronase浓度可有效抵消抑制剂影响。完成酶解后通过SDS-PAGE去除大量短肽再利用高分辨率质谱完成蛋白鉴定及定量分析。DARTS实验结果分析对于DARTS实验而言电泳胶图主要用于初步观察并不能作为最终判断依据。由于条带变化往往较小高分辨率质谱才是筛选候选靶点的核心分析手段。通常高可信度候选蛋白需满足以下几个评价标准Unique peptide独有肽段不少于2条FDR错误发现率优先选择High0.01或Medium等级P值小于0.05保证结果具有统计学意义Fold ChangeFC达到筛选标准其中FC1.2或1.5提示蛋白抗酶解能力增强FC0.833或0.667则提示结合后稳定性降低同样值得进一步研究。对于实验中出现的缺失值一般采用1/10th最小值赋值法进行统计处理从而提高数据分析的稳定性和候选蛋白筛选效率。DARTS与LiP-MS技术对比目前DARTS和LiP-MS都是非标记药物靶点发现的重要技术路线但两者分析重点有所区别。DARTS采用单步限制性酶解主要分析蛋白整体稳定性变化因此操作流程较简单更适用于复杂真核裂解液、天然产物、中药复方以及老药新用研究。LiP-MS则采用蛋白酶KPK联合胰酶进行两步酶解通过分析局部肽段变化研究蛋白构象改变更适用于简单体系及代谢物研究。由于LiP-MS实验会产生大量完全酶解及半酶解肽段在复杂样本中容易形成较高背景高丰度蛋白更容易获得检测机会而低丰度调控蛋白容易受到干扰。因此对于复杂生物样本而言DARTS通常具有更好的综合表现。DARTS技术应用实例近年来DARTS在多个药物机制研究中取得了丰富成果。暨南大学研究团队利用DARTS发现抗过敏药氮卓斯汀Azelastine能够直接结合ARF1通过调控线粒体裂变抑制结直肠癌细胞增殖。重庆医科大学利用DARTS证实雷公藤红素Celastrol能够直接作用于ChREBP并调控ChREBP-TXNIP信号轴改善糖尿病并发症。上海中医药大学研究发现人参皂苷Rb1可直接结合RNA结合蛋白QKI抑制circ-0034880形成从而阻断肿瘤肝转移。中国药科大学则利用DARTS发现真菌来源单体化合物能够结合DCTPP1通过影响氨基酸代谢发挥抗肿瘤作用。DARTS技术局限性虽然DARTS具有较高的可靠性和广泛的适用性但仍存在一定局限。首先部分非特异性结合也可能改变蛋白稳定性因此筛选出的候选蛋白需要进一步结合Western Blot、SPR及细胞功能实验进行验证。其次胶图没有明显差异并不能说明实验失败因为真正的数据分析主要依赖高分辨率质谱。对于膜蛋白而言由于提取效率相对较低其检出率通常受到一定限制而带有复杂翻译后修饰PTM的蛋白也可能增加质谱鉴定难度。此外DARTS能够证明药物与蛋白发生结合但无法直接判断结合后的功能变化因此还需要进一步开展功能验证实验。总体来看DARTS凭借无需标记、实验流程规范、适用于复杂样本以及较高的数据可靠性已经成为现代药物靶点发现的重要技术平台。未来随着精准蛋白组学、多组学联合分析及人工智能技术不断发展DARTS将在创新药研发、天然产物研究及精准医疗领域发挥更加重要的作用。达吉特DARTS技术服务文献部分客户文献[1]. Zhou J, Song Q, Li H, et al. Targeting circ-0034880-enriched tumor extracellular vesicles to impede SPP1highCD206 pro-tumor macrophages mediated pre-metastatic niche formation in colorectal cancer liver metastasis. Mol Cancer. 2024;23(1):168. Published 2024 Aug 20. doi:10.1186/s12943-024-02086-9.(上海中医药大学附属曙光医院) IF27.7[2]. Zhang W, Song Y, Li C, et al. Canagliflozin Alleviates Diabetic Glomerular Endothelial Injury via Melibiose in a Microbiota-Dependent Manner. Adv Sci (Weinh). Published online May 27, 2026. doi:10.1002/advs.202517222.郑州大学第一附属医院IF14.1[3]. Yang X, Lin G, Chen Y, et al. Chlorquinaldol Alleviates Lung Fibrosis in Mice by Inhibiting Fibroblast Activation through Targeting Methionine Synthase Reductase. ACS Cent Sci. 2024;10(9):1789-1802. Published 2024 Aug 28. doi:10.1021/acscentsci.4c00798.广州医科大学IF12.7[4]. Liang Y, Zhang YL, Cheng TY, et al. Senkyunolide H potentiates bone marrow-derived mesenchymal stem cells therapy for liver cirrhosis by targeting MAEA to enhance ERK-driven HGF secretion. Pharmacol Res. 2026;226:108160. doi:10.1016/j.phrs.2026.108160.上海中医药大学IF10.5[5]. Zhao R, Lu Y, Xu Q, et al. Gut blautia coccoides-derived 5Z-dodecenoic acid attenuates chronic psychological stress-induced gastric cancer progression. Int J Surg. Published online November 20, 2025. doi:10.1097/JS9.0000000000004080.(中国人民解放军总医院第一医学中心) IF10.3[6]. Zhang S, Tang L, Pu Y, et al. Patchouli alcohol triggers autophagic cell death in non-small cell lung cancer cells through targeting GNAI1 to dissociate the GNAI1/ARRB1 complex. Int J Biol Sci. 2026;22(8):4004-4024. Published 2026 Mar 30. doi:10.7150/ijbs.125690.中国上海市宝山区吴淞中心医院IF10.0