Section.01什么是双荧光素酶实验双荧光素酶实验(Dual-Luciferase Reporter Assay) 是一种广泛应用于分子生物学的经典实验技术主要用于定量检测基因表达水平以及验证生物大分子之间的相互作用(如 miRNA 与靶基因、转录因子与启动子)。核心原理该实验利用荧光素酶基因转染到细胞中通过检测其产生的荧光素酶活性 (“生物发光”) 来量化目标基因的表达水平。实验中会同时使用两种荧光素酶萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase, F-Luc) 和海肾荧光素酶 (Renilla Luciferase, R-Luc)。『报告基因 (F-Luc)』将你感兴趣的调控元件(如启动子、基因的 3-UTR 区域)克隆到萤火虫荧光素酶基因的上下游。当调控元件被激活或靶向结合时发光的强度会发生变化。『内参基因 (R-Luc)』作为对照。由于细胞数量、转染效率等外在因素会影响实验的绝对发光值海肾荧光素酶作为一个稳定的基础参照可以用来校正这些误差。在 ATP 和荧光素酶存在下D-荧光素 (D-Luciferin) 能够被氧化发出波长为 570 nm 左右的生物萤光 (图 1)。当荧光素过量时发光亮度与荧光素酶浓度呈正相关广泛用于荧光素酶报告基因的检测。图 1. D-荧光素发光原理。在 O2 存在条件下海肾荧光素酶可以将腔肠荧光素 (coelenterazine) 氧化成腔肠酰胺 (coelenteramide)并发出波长为 480 nm 左右的生物萤光 (图 2)。海肾荧光素酶作为双荧光素酶报告基因的内参消除了细胞生长状态、数量、转染效率等差异的影响使得检测结果的准确性更高。图 2. 腔肠素发光原理。核心应用高通量筛选(HTS)基于荧光素酶的高灵敏度科学家可以快速筛选靶向化合物。随后可通过正交实验 (如基于同一底物的 ATP 检测法) 来排除假阳性从而确认药物的真实靶点结合能力与生物学活性。动物活体成像 (IVIS)利用活体成像仪可无创、实时、动态地追踪动物体内的目标细胞 (如肿瘤细胞或免疫细胞) 生长、转移以及对药物的响应。这一活体水平的数据通常与离体细胞的 ATP 代谢水平检测及荧光素酶定量分析相结合实现从“宏观整体 (活体) ”到“微观局部 (体外) ”的多维度相互印证。肿瘤药物研发在评估抗肿瘤药效时活体成像不仅能追踪瘤体大小变化由于萤火虫荧光素酶发光严格依赖于 ATP它还能通过 ATP 的丰度变化来直观反映活细胞的代谢活跃度以及药物杀伤机制。基因治疗在监测基因递送效率 (如 mRNA 或 siRNA 递送) 时科学家常将荧光素酶基因作为报告基因通过检测荧光素酶活性水平来评估基因的表达强度并借此比对不同递送载体的转染效率。双荧光素酶实验在基因调控、蛋白互作及药物筛选等领域提供了强大的技术支持有力推动了生物医学研究与药物开发进程[1]。本期我们就来聊聊双荧光素酶实验的那些事儿~Section.02双荧光素酶报告基因检测(分子水平)实验步骤[2][3][4](1) 将双荧光报告基因构建入不同质粒或同一质粒中。(2) 将质粒转染入目标细胞。(3) 细胞培养一天后以冰冷 PBS 清洗一遍加入 80-100 µL lysis buffer。(4) 冰上被动裂解 30 min。(5) 4℃12000 rpm 离心 10 min。(6) 吸取上清 10 µL 于 luciferase 专用 96 孔板。(7) 依次加入 50 µL Firefly Luciferase Buffer (FB) 与 50 µL Renilla Luciferase Buffer (RB)。(8) 酶标仪检测 550-570 nm 和 480 nm 的荧光强度。注意事项(1) 需加入足量底物保证底物的饱和否则会造成检测结果出现很大偏差。(2) 室温反应。反应时各个组分 (细胞裂解产物底物工作液等) 都需要调整到室温。(3) 荧光素酶的半衰期一般约 30 min加完底物后可立即检测尽量在 30 min内完成。(4) 底物避光密封保存萤火虫荧光素酶底物 -20℃ 保存 海肾荧光素酶底物推荐 -80℃ 保存。(5) 荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏复孔之间的数值有一定差异是正常的。表1. 实验常见问题及分析。Section.03利用萤火虫荧光素酶进行 ATP 检测(细胞水平)细胞内 ATP 活性测定检测细胞活力『1. 标准曲线』建立 ATP 浓度和发光强度的标准曲线[8] (可选)(1) 细胞准备将 HEK293-pmeLUC 细胞种在 24 孔板中 (7×104 细胞/孔)培养 24 小时。(2) IVIS 初始化启动 IVIS 成像仪冷却至 -90℃设置曝光时间 1 分钟、Binning 4、光圈 F/STOP1选择荧光和照片叠加模式。(3) 发光测量每孔加入 8 µL 的 D-荧光素 (15 mg/mL)等待 3 分钟然后采集发光图像。(4) 建立标准曲线在细胞孔中加入不同浓度的 ATP (1-1000 μM)轻轻混匀再次采集发光图像。(5) 可选对照加入 5U 的 apyrase (一种 ATP 水解酶)发光应完全消失证明信号确实来自 ATP。(6) 图像处理用 Living Image 软件圈出每个孔的兴趣区域 (ROI)导出 “Total Flux”(光子/秒)扣除背景绘制 ATP 浓度 vs. 发光强度的标准曲线并得到趋势线方程。『2. ATP 检测』以 3D Cell-ATP Viability Detection Kit 为例(1) 试剂准备按照 96 孔板 (每孔 100 μL 细胞培养基) 加入 100 μL 细胞活力检测试剂的量即 V 细胞V 细胞活力检测试剂 1:1取适量本产品解冻后平衡至室温。注本品首次解冻后建议适当分装避免反复冻融。(2) 细胞活力检测取出待检测的细胞培养板室温平衡 30 min。(3) 每孔加入 100 μL 活力检测试剂室温振荡混匀 5 min 以促进细胞充分裂解。(4) 将细胞培养皿室温孵育 25 min使发光信号趋于稳定。(5) 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光测定记录发光值每个孔的检测时间一般为 0.25-1 s。注意事项(1) 具体参数可根据仪器类型及检测灵敏度进行适当调整。(2) 活力检测试剂渗透进入 3D 细胞及发光信号趋于稳定的时间与细胞种类、培养时间、3D 细胞团大小均有关可以通过使用移液器反复吹打来替代振荡操作。(3) 可以在加入活力检测试剂振荡 5 min孵育 5 min 后直接开始检测每隔 5min 检测收集一次发光值取发光信号趋于稳定的时间点对应发光值作为实验数据。(4) 检测效果因细胞的种类不同而异对于一些 ATP 含量特别高的细胞在细胞数量达到 100,000 以上可能会出现化学发光读数继续升高但丧失线性关系。Section.04动物活体成像实验(动物水平)实验原理荧光素所发的光很容易透过组织在体内代谢较慢而且特异性好。所以大部分活体成像实验采用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因。哺乳动物发荧光一般是将萤火虫荧光素酶 (firefly luciferase) 基因整合到被观察细胞染色体的 DNA 上让细胞表达荧光素酶培养出能稳定持续表达荧光素酶的细胞株当细胞分裂、分化时荧光素酶也会得到表达。标记后的荧光素酶在活细胞内会产生发光现象且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关[5][6]。图 3. 体内成像系统监测肿瘤生长[7]。实验步骤[6](1) 通过尾静脉注射荧光素酶标记的 1 × 106 个 MOLM-13-Luc 细胞到小鼠体内建立肿瘤模型。(2) 接种后待肿瘤生长 6 天后开始每日灌胃给药 (定义为治疗第 0 天)剂量为 200 或 400 mg/kg。(这步可以根据自己实际的实验方案而定)(3) 采用生物发光成像 (BLI) 技术使用 IVIS 体内成像系统通过腹腔注射 150 mg/kg D-荧光素钾盐评估肿瘤生长情况。图 4. 小鼠体内成像[6]。Section.05常见问题与答疑[2][6][9][10][11]D-荧光素钠盐、D-荧光素、D-荧光素钾盐关系是什么Luciferin 的常见形式有钠盐和钾盐是萤火虫荧光素酶的底物两种盐的水溶性都很好且两者有着相同的化学发光发射波长在应用上没有差别。使用效果生物活性上是等效的。溶解度不同。表 2. D-荧光素钠盐、D-荧光素、D-荧光素钾盐的区别。D-荧光素和荧光素关系是什么两个产品生物活性上不等效应用范围不同。表 3. D-荧光素和荧光素的区别。D-荧光素氧化发光的过程需要镁离子和 ATPD-荧光素钾盐做体外成像的话ATP 和镁离子怎么满足呢体外成像时通常使用添加了 ATP 和镁离子的细胞培养基来稀释探针。不过大多数细胞自身所含的 ATP 和镁离子已足以支持 D-荧光素底物的反应但不同细胞类型的内源性含量存在差异。因此建议先进行预实验尝试使用不额外添加 ATP 和镁离子的培养基以评估实际成像效果。D-荧光素动物实验什么时候检测合适腹腔注射荧光素后细胞约 3 分钟开始发光 10 分钟达稳定峰值持续 10-15 分钟后衰减最佳检测窗口为注射后 10-15 分钟。注意建议通过预实验绘制荧光素酶动力学曲线以确认实际的最强信号时间和平台期[6]。海肾荧光素酶的作用是什么海肾荧光素酶作为双荧光素酶报告基因的内参校正细胞生长状态、数量、转染效率等差异的影响使得检测结果的准确性更高[10]。不同荧光素酶有什么区别检测时荧光值过高如何解决减少质粒转染量细胞样品裂解后离心取上清后可适当稀释后检测。不建议通过减少底物量来降低荧光值需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平否则会造成检测结果出现大的偏差。参考文献[1] David S McNabb, et al. Dual Luciferase Assay System for Rapid Assessment of Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 2005 Sep;4(9):1539–1549.[2] Xiaochen Wang, et al. Resistance to anti-LAG-3 plus anti-PD-1 therapy in head and neck cancer is mediated by Sox9 tumor cells interaction with Fpr1 neutrophils. Nat Commun. 2025 Apr 28;16(1):3975.[3] J Stables, et al. Development of a dual glow-signal firefly and Renilla luciferase assay reagent for the analysis of G-protein coupled receptor signalling. J Recept Signal Transduct Res. 1999 Jan-Jul;19(1-4):395-410.[4] Nina Solberg, et al. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 2013:977:65-78.[5] Yusuke Inoue, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growth using in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010:2010:471408.[6] Xuejiao Shirley Guo, et al. Prioritization of Eleven-Nineteen-Leukemia Inhibitors as Orally Available Drug Candidates for Acute Myeloid Leukemia. J Med Chem. 2024 Nov 12;67(22):20100–20117.[7] Doyle K, et al. A Comparison of in vivo Tumor-Homing Abilities of Placental-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells in High-Risk Neuroblastoma. J Pediatr Surg. 2025 Jan;60(1):161954.[8] Giampaolo Morciano, et al. 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