● 期刊: Cell host Microbe —— 2021● 文章链接:Birthmode and environment-dependent microbiota transmission dynamics are complemented by breastfeeding during the first year - ScienceDirecthttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S193131282400177X● Author: Marta Selma-Royo●2026.0301第一次翻译校准蘑菇菌和木糖菓菓●2026.0703第二次翻译校准木糖菓菓图片摘要与说明研究团队认为分娩方式与出生地点会影响肠道菌群的传递过程而母乳喂养则会调节长双歧杆菌不同亚种的更替模式。整体而言上述因素共同塑造了菌群的垂直传递规律进而影响生命早期婴幼儿的肠道菌群定殖过程。本文核心观点●医院分娩与家庭分娩影响婴儿微生物群的传递●母乳是婴儿第一年微生物群组成发育的关键调节器因素●不同分娩方式和地点之间物种的可传递性传递能力有所不同但双歧杆菌除外●母乳喂养的持续时长影响长双歧杆菌菌株的存留和功能多样性总结摘要生命早期菌群的组成与成熟过程受多种围产期因素调控目前学界尚未充分阐明这些因素在微生物垂直传递过程中的交互作用机制。本研究依托近年发展的菌株溯源技术针对两类不同出生环境下的母婴配对样本开展母婴菌群传递分析分别为医院出生的婴幼儿含顺产/剖宫产两种分娩方式及其母亲以及居家顺产出生的婴幼儿及其母亲。尽管分娩方式是解释婴儿初始菌群组成差异的核心因素但出生地点会直接影响菌群传递的时间特征居家分娩的菌群传递启动更早剖宫产的菌群传递则存在延迟。不同物种、不同出生组间的菌群传递模式存在显著差异但长双歧杆菌等特定物种不受分娩场景影响始终稳定发生垂直传递。针对长双歧杆菌的菌株水平分析揭示了具有一致规律的长双歧杆菌亚种的更替特征该特征主要由母乳喂养行为驱动其核心机制是母乳低聚糖HMO的降解能力随喂养过程发生动态变化。本研究结果表明分娩场景、母乳喂养时长及其他生活偏好因素会共同塑造菌群垂直传递过程进而影响生命早期婴儿的肠道菌群定植。前言生命早期微生物定植是人体微生物组建立过程中的核心环节而人体微生物组可发挥多项关键生理功能。婴幼儿肠道的初始微生物定植由母体菌群传递启动该过程中微生物会与婴幼儿体内的发育中系统形成复杂互作尤其会作用于肠道上皮与免疫系统。尽管目前学界尚未完全阐明该过程的全部机制但剖宫产、配方奶喂养、抗生素使用等围产期因素均会扰动婴幼儿的微生物定植模式这类菌群扰动已被证实与肥胖、特应性疾病等非传染性疾病的发生相关凸显了生命早期微生物-宿主互作的重要性及其长期影响。少数因果性研究证实剖宫产婴幼儿的菌群可通过母体粪菌移植等方式实现正常化恢复但现有绝大多数研究仅聚焦这类因素对婴幼儿菌群组成的影响并未探究其对微生物垂直传递的作用以及该作用与婴幼儿健康的潜在关联。此前基于菌株水平宏基因组的分析结果显示相较于其他来源的菌株母体肠道菌群来源的菌株在新生儿肠道中的定植生态适应性更强这也印证了母体菌群是新生儿核心微生物定植源的核心地位。尽管母体菌群对新生儿初始定植的作用已被众人认可但目前学界仍不清楚母体生活方式及相关因素如何调控向新生儿的细菌传递过程。本研究系统分析了出生地点、分娩方式与喂养模式对出生后首年婴幼儿肠道菌群定植及微生物垂直传递过程的影响。此前我们团队及其他研究团队已报道出生地点与分娩方式可对出生1月龄内的新生儿菌群特征产生影响但这类早期研究均采用16S rRNA基因扩增子测序技术该方法无法达到菌株分辨率难以精准评估菌株共享特征因此无法实现对微生物垂直传递过程的有效解析。本研究结果证实分娩方式与出生地点仅在生命最初数月内对菌群组成和传递产生作用更关键的是研究发现大量物种不受分娩方式、出生地点的限制可稳定实现垂直传递其中包含双歧杆菌属这类婴幼儿肠道核心菌群物种。针对高检出率、高传递效率的长双歧杆菌本研究进一步明确了喂养习惯可显著调控其菌株留存与更替动态为后续深入探究母乳喂养在微生物初始定植与菌群建立过程中的作用提供了核心支撑。结果和讨论1围产期各类因素对婴儿肠道微生物群发育影响的队列研究为探究出生地点医院/居家与分娩方式顺产/剖宫产对出生后第一年内婴幼儿肠道菌群发育的影响本研究共纳入34组母婴配对样本表1在该时段内开展随访同步采集粪便样本纵向研究与母乳样本表S1。所有家庭按出生地点与分娩方式分为三组提前选择居家分娩的家庭居家分娩组HBn10、医院顺产组VAGn13、医院剖宫产组CSn11。受试者均纳入“母体微生物MAMI”队列该队列旨在解析围产期因素对婴幼儿肠道定植与健康结局的作用。分别在婴幼儿出生后1周7天、1月龄、6月龄、12月龄四个时间点通过宏基因组测序分析婴幼儿粪便菌群同时对产后1月龄采集的母体粪便与母乳样本开展宏基因组测序明确两类微生物来源在母婴细菌垂直传递中的贡献。针对全部161份婴幼儿与母体粪便样本、27份母乳样本仅6份因测序深度 100万 reads 被保留图S1A采用菌株水平分析工具追踪微生物菌株的垂直传递过程以及菌株在婴幼儿菌群内随时间的留存特征。完成DNA提取与测序后经质量过滤每份粪便样本的读长中位数为3100万四分位距2000万-4300万详见STAR方法、表S1。母乳样本虽DNA浓度满足测序要求但多数样本因微生物读长占比过低部分样本占比1%被剔除最终仅6份样本的微生物读长超过阈值母乳样本阈值为 100万reads进入后续分析。本研究纳入的母体均处于世界卫生组织定义的正常体重指数区间18.5-24.9孕期总增重也处于推荐范围内。所有婴幼儿均为足月产其中91%31/34的婴幼儿在出生后前6个月接受过至少部分母乳喂养表1图S1B。从MAMI队列筛选的三组样本在出生后1周的母乳喂养率保持一致但居家分娩的婴幼儿纯母乳喂养时长更长12月龄时的部分母乳喂养占比也更高。医院分娩的婴幼儿在出生后1月龄内的纯母乳喂养占比更低6-12月龄的部分母乳喂养占比也更低。所有剖宫产组的母婴配对样本均在产时使用了预防性抗生素。2医院分娩与家庭分娩对MAMI婴儿微生物群组成的影响为解析婴儿早期肠道菌群组成的时间动态演化规律本研究对婴幼儿出生后首年的粪便样本开展分析。与此前研究结论一致婴幼儿肠道菌群会持续富集新物种逐步向成人样菌群组成过渡该特征在12月龄时已十分显著图1A表S2。出生后1月龄内、尤其是出生后第一周新生儿菌群以Escherichia coli和Bifidobacteriumsp. 为绝对优势类群包括B. breve和B. longum不同组别的高丰度物种组合存在差异剖宫产组第1周时的90百分位最高丰度物种为E. coli和B. breveHB组居家分娩组为B. breve和B. longum顺产组为E. coli和B. longum图1A表S2、S5。这类物种被公认为婴幼儿肠道的先锋定殖定植菌在出生后的第一周前即可完成定植且在多个时间点均维持高丰度1月龄时所有分组的90%样本的最高丰度物种均为B. breve和B. longum6月龄时剖宫产组的高丰度物种为B. breve和B. longumHB组和顺产组为B. longum和B. pseudocatenulatum图1A表S2、S5。图1 | 不同时间点、分娩地点及分娩方式下的母婴微生物群组成12月龄时婴幼儿肠道菌群已转变为更接近成人的组成特征与产后1月龄母体肠道菌群的相似度显著提升图1A、1B表S2统计结果显示12月龄时母婴间的Jaccard距离显著低于1月龄事后Dunn检验所有校正后P值均 0.05图S1B表S2。6月龄和12月龄新出现的物种均具备发酵多种碳水化合物的能力包括Faecalibacterium prausnitzii以及Blautia、Eubacterium、Roseburia属的多个物种。婴幼儿月龄增长菌群组成的整体变化伴随香农多样性持续升高该差异在12月龄时最为显著Kruskal-Wallis检验卡方值39.7412月龄与其余各时间点的事后Dunn检验校正后P值均0.05图1C表S2但12月龄婴幼儿的菌群多样性仍显著低于母体事后Dunn检验校正后P值5.89×10⁻³图1C表S2。我们推测该变化主要由断奶和辅食引入驱动本队列中6月龄时纯母乳喂养的婴幼儿占比为34%11/3212月龄时已无纯母乳喂养的婴幼儿图S1B表S1。我们专门对比了辅食引入即纯母乳喂养结束前后的物种检出率差异共筛选出21个检出率存在显著差异的物种费希尔精确检验校正后P值0.05表S2其中仅2个物种在纯母乳喂养期的检出率更高比值比1即Staphylococcus hominis和Staphylococcus epidermidis该现象大概率源于母乳喂养过程中母婴间的皮肤接触。婴儿整体肠道菌群向母亲菌群趋同的成熟规律可通过母婴间整体菌群组成差异即β多样性的时间动态变化进一步证实尽管所有时间点的母婴菌群组成均存在显著差异PERMANOVA校正后R²14.41%P1×10⁻³图1B表S2STAR方法但该差异在出生后第一周达到峰值随后在婴幼儿首年中持续降低1周、1月、6月、12月的校正后R²分别为22.81%、19.52%、17%、13.86%所有时间点校正后P值均为1×10⁻³表S2。在所有协变量中月龄是解释婴幼儿菌群变异的核心因素分娩条件也存在显著影响排除剖宫产样本后出生地点居家/医院对菌群变异的解释度高于医院内的分娩方式差异顺产/剖宫产分步PERMANOVA分析显示校正月龄后出生地点的R²为0.93%P2×10⁻³而仅纳入医院样本时校正月龄后分娩方式的R²仅为0.25%P4.4×10⁻²。在出生后首年的各独立时间点中出生地点对婴幼儿菌群组成变异的影响持续时间更长1周、1月、12月的PERMANOVA校正后R²分别为2.21%、2.28%、1.83%所有时间点校正后P值均为2×10⁻²而分娩方式仅在出生后第一周存在显著影响PERMANOVA R²2.36%校正后P值5×10⁻²。婴幼儿性别在所有时间点均不会影响菌群组成所有PERMANOVA校正后P值均0.05且在分步模型中性别变量的解释力始终无法超过分娩方式所有校正后P值均0.05。综上在出生后1月龄内我们观察到婴幼儿肠道物种组成随分娩方式不同存在差异CS组与顺产组对比图1A表S2后续时间点的核心差异则由出生地点决定即家庭分娩组与医院分娩组的菌群特征存在显著差异。尽管经多重检验校正后无物种达到统计学显著性阈值校正后P0.05该现象大概率由检验次数过多导致但多个物种在校正前已满足P0.05的显著性标准。出生后1周时剖宫产新生儿的Bifidobacterium longum威尔科克森秩和检验r0.379P3.40e-2与Bacteroides vulgatusr0.373P3.72e-2相对丰度更低Klebsiella pneumoniaer0.480P7.22e-3与K. variicolar0.402P2.446e-6丰度显著升高而在12月龄时与其余两组相比居家分娩婴幼儿的肠道菌群中Bifidobacterium longumr0.403P3e-2与Enterococcus faecalisr0.432P2.15e-2丰度更高Ruminococcus gnavusr0.551P2.04e-3、Clostridium innocuumr0.566P2.48e-3、Streptococcus thermophilusr0.373P4.70e-2丰度更低所有统计结果详见表S2。与之对应的是本研究发现居家分娩对婴幼儿菌群的影响在出生6月龄后仍可被检出此时婴幼儿的菌群谱已与母体菌群特征更为相似。本研究提出假设居家分娩婴幼儿的菌群组成变化可能与母体生活方式和环境差异相关这类差异会直接体现在居家分娩母亲与医院分娩母亲的菌群组成分化上图S2。实际统计结果显示仅在母体样本中不同分娩分组的香农多样性指数存在显著差异Kruskal-Wallis检验卡方值7.07P2.91e-2表S2居家分娩组母亲的菌群多样性显著高于剖宫产组母亲事后Dunn检验校正后P1.43e-2表S2。考虑到母体样本采集于产后1月龄该差异可能源于剖宫产分娩过程中常规使用的产时抗生素这类抗生素会降低母体菌群多样性与未暴露于该类抗生素的母亲形成显著差异。但此前流行病学登记数据也显示计划居家分娩的母亲群体本身存在特定的人口学特征差异其中部分特征与生活方式相关。本研究进一步将饮食作为调控居家分娩母亲菌群的潜在因素开展分析但不同分娩分组的主要营养类别摄入未观测到显著差异表S1。因此本研究未纳入调查的其他母体相关因素比如生活方式特征也可能是导致母体菌群组成差异的重要驱动因素。3母乳作为第一年微生物群播种动态的关键调节剂在本研究纳入的所有调查因素中选择居家分娩的决策此前已被证实与更长的母乳喂养时长存在关联本研究人群中也观测到了该关联费希尔精确检验OR0校正后P值3.61e-2表S1。尽管该关联大概率不具备因果性但仍需充分考量与居家分娩相关的各类因素对本研究观测结果的潜在影响。为探究母乳喂养在不同出生分组的婴幼儿菌群构建过程中发挥的作用本研究通过分析27份母乳宏基因组测序样本其中10份来自医院顺产母亲、8份来自剖宫产母亲、9份来自居家分娩母亲评估母乳作为婴幼儿菌群物种潜在来源的贡献。受部分样本测序读长限制读长中位数为24万最小值53133最大值3100万表S1本部分仅统计物种的检出/缺失状态不开展相对丰度相关分析。值得关注的是母乳样本中检出的物种恰好也是出生后前6个月婴幼儿肠道菌群中的高丰度物种包括Bifidobacterium longum、Staphylococcus epidermidis和Enterococcus faecalis图1A、图S1CSTAR方法。除此之外母乳中检出的物种在婴幼儿肠道物种总丰富度中的占比随月龄增长持续下降出生后1周婴幼儿肠道中43.06%的物种可在母乳中检出四分位距35.61%~46.15%在出生后首年中该占比持续降低1月龄、6月龄、12月龄的中位数分别为24.04%、15.13%、8.13%Kruskal-Wallis检验卡方值37.2P4.17e-8图S1D、图S1E表S2。尽管受样本量有限、低读长样本被剔除的限制菌株层面分析的可用样本较少本研究仍观测到多组菌株共享事件其中1组发生在母亲的母乳样本与肠道样本之间4组发生在母乳样本与对应婴幼儿的肠道样本之间涉及物种包括Enterococcus faecalis和Escherichia coli表S3。本研究通过宏基因组手段证实母乳是生命最初数月内向婴幼儿菌群输送细菌物种的潜在来源之一拓展了此前基于其他测序技术和培养法开展的相关研究结论。后续需依托菌株分辨率的宏基因组技术、扩大队列规模开展专门针对母乳微生物向婴幼儿肠道传递的研究进一步验证该结论。4除双歧杆菌外不同物种的传递能力会因为传递途径和地点有所差异为进一步明确分娩方式与出生地点对婴幼儿肠道菌群定植的影响本研究采用菌株水平的基于图谱的宏基因组分析工具统计婴幼儿肠道中可与对应母亲共享的细菌菌株占比以此判定潜在的垂直传递事件详见STAR方法表S3。本研究定义了两项用于表征母体垂直传递特征的指标「菌株共享率」与「婴儿菌株获得率」。菌株共享率指同时在母婴双方检出的物种中可在菌株层面实现共享的物种占比婴儿菌株获得率指婴幼儿肠道所有菌株中可与母亲共享的菌株占比。两项指标可从不同维度反映垂直传递特征前者体现母婴共有物种在菌株层面实现共享即可能由母亲传递的概率后者通过统计婴幼儿肠道菌群中可溯源至母体的比例体现母体作为菌株定殖源的整体贡献。本研究还额外定义了「物种传递率」即某一特定物种中SGB检测菌株共享StrainPhlan功能详细分析可见博主文章《技术避坑一MetaPhlan 4和StrainPhlan 4联用分析菌株水平的传递》可检测到母婴菌株共享事件的家庭占比用于筛选频繁参与菌株共享事件的核心物种。整体来看菌株共享率在早期时间点更高后续随月龄增长逐步下降Kruskal-Wallis检验卡方值10.04P1.82e-21周与12月的事后Dunn检验校正后P值2.5e-21月与12月的校正后P值3e-2图2A表S3该现象大概率由辅食引入后菌群多样性升高导致。在婴幼儿出生后首年中婴幼儿肠道菌群与母体共享的整体占比未出现显著变化婴幼儿获得率即婴幼儿肠道菌株中同时在母体检出的比例随时间保持稳定Kruskal-Wallis检验卡方值4.12P0.25图2A表S3且不同分组间无显著差异Kruskal-Wallis检验卡方值2.88P0.24图2B表S3。针对母婴间菌株共享程度最高的物种开展分析可得到与分娩地点、分娩方式相关的特征规律图2C。其中16.13%的物种10/62可在所有分娩分组中实现垂直共享4种 Bifidobacterium 物种B. longum、B. pseudocatenulatum、B. bifidum、B. adolescentis的传递率始终高于33%图2C。值得关注的是无论分娩地点与分娩方式如何只要B. longum在母婴双方均检出其在超过50%的家庭中均可实现垂直传递且在顺产婴幼儿出生后短时间内的检出率极高1周时CS组检出率9%VAG组55%HB组67%表S2。另一项更具突破性的观测结果针对Blautia wexlerae只要该物种在母婴双方均检出无论分娩地点与分娩方式其菌株共享比例均超过75%且在VAG组中传递率可达100%。与B. longum类似B. wexlerae的整体检出率极高在12月龄婴幼儿与母体中达到峰值12月时CS组检出率60%VAG组90%HB组66.7%母体中CS组检出率87.5%VAG组66.7%HB组100%表S2。尽管 Bifidobacterium 是生命早期菌群领域研究最充分的菌属之一已被反复证实属于垂直传递占比最高的类群且被证实与婴幼儿发育相关但这类母体传递物种在婴幼儿肠道与免疫系统发育中的潜在作用仍未被完全阐明。针对Blautia wexlerae的相关研究相对更少此前研究发现该物种在肥胖、胰岛素抵抗的儿童体内丰度显著降低且体外细胞实验证实其对外周血单核细胞具有抗炎作用提示其可能在生命早期参与免疫调控。但本研究关于Blautia wexlerae的结果与已有结论存在差异后者认为该物种极少由母体传递通常从其他外源环境获得因此该物种在垂直传递中的实际贡献仍需进一步验证。本研究进一步观测到部分物种仅在顺产场景下实现垂直传递且该特征不受出生地点影响这类物种包括Agathobaculum butyriciproducens、Ruminococcus torques、Slackia isoflavoniconvertens和Bacteroides vulgatus图2C。另一类值得关注的物种组包含F. prausnitzii、E. coli和Streptococcus salivarius可在家庭分娩组的母婴双方体内检出但从未观测到菌株层面的共享事件提示医院环境可能对这类物种的垂直传递过程存在调控作用。值得注意的是与顺产相关的这类物种在剖宫产婴幼儿体内完全缺失或检出率极低。本研究结果与此前相关研究结论一致有研究发现相较于剖宫产婴幼儿顺产婴幼儿体内多个Bacteroidesspp.的丰度显著升高其中Bacteroides vulgatus是顺产场景下被鉴定到最多垂直传递事件的物种。另一独立队列研究也得到了相似结果该研究同时发现顺产场景下实现垂直传递的菌株中多个具备免疫激活潜力的功能通路发生富集。与之相反与医院分娩相关的物种在家庭分娩组婴幼儿体内的检出率同样处于较高水平只是这类物种未与母体发生菌株层面的共享图2C。该结果提示这类物种并非来源于医院环境而是在临床分娩场景下更多通过母体完成传递但在居家分娩场景下这类物种则从其他外源环境获得两组中位传递率分别为50%和0该差异大概率源于居家环境的消杀程度更低。5母亲对婴儿肠道微生物群的贡献大多发生在HB新生儿早期进一步深入分析传递动态规律后本研究发现不同物种、不同分娩分组的首次定殖时间存在显著差异。观测结果显示出生后首月内顺产婴幼儿从母体获得的新物种数量更多且该特征不受出生地点影响1月龄前CS组与顺产组对比费希尔精确检验OR3.44校正后P值2.53e-2图3A表S3。但在后续月龄6~12月龄居家分娩婴幼儿的新传递共享物种数量少于医院分娩婴幼儿6月龄及之后HB组与医院分娩组对比费希尔精确检验OR0.34校正后P值2.53e-2。‌图3 | 不同物种的菌株传递事件发生时间进程与菌株留存率对比出生后首月与6~12月龄两个时段的结果可见剖宫产婴幼儿在6月龄后首次获得的菌株数比首月多6.2个医院顺产婴幼儿多2.47个居家分娩婴幼儿仅多1.11倍表S3。该结果提示剖宫产会限制生命早期的菌株共享而居家分娩新生儿比其余分组更早获得绝大多数母体菌株在后续时间点母体向婴幼儿的菌株传递过程会受不同出生地点相关因素或生活方式因素的调控。本研究提出假设HB组更长的母乳喂养时长是这类影响因素之一该因素可能会阻碍婴幼儿获得新的成人样物种这类物种可替代原本专性代谢母乳糖类的菌群。实际观测结果也印证了这一点医院分娩婴幼儿在出生后首月的纯母乳喂养占比更低图S1B表S1。‌图2 | 母婴队列的整体菌株获得率与菌株共享率特征其中Bifidobacterium longum、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Bifidobacterium bifidum这类物种无论出生地点如何都会在顺产新生儿生命早期更早完成首次定植图3B、图S4该结果与此前相关研究结论一致。值得关注的是这类在顺产婴幼儿体内早期定植的物种同时也是出生后首年菌株替换率更高的物种菌株替换率定义为同一婴幼儿连续两个时间点检出不同菌株的占比详见STAR方法图3C。驱动这类早期菌株替换速率升高的机制以及该现象对婴幼儿菌群发育的影响仍有待阐明该过程大概率与出生后首年饮食结构发生的剧烈变化相关。与之相反Akkermansia muciniphila、Anaerostipes hadrus、Gemmiger formicilis这类首次定植时间更晚的物种其与母体的菌株层面共享率不受分娩方式和出生地点影响始终维持在相近水平。这类物种是成人菌群的典型组成类群已知其定植时间普遍偏晚大概率是因为它们可利用的碳源与母乳来源的糖类存在差异。综上本研究观测结果证实不同物种的传递能力与菌株留存特征存在物种特异性差异提示菌株传递动态过程可能由特定事件驱动和调控例如剖宫产会导致菌株定植延迟、居家分娩的特殊环境、或是断奶阶段的饮食结构转变。6母乳喂养时间影响长双歧杆菌的菌株保留和功能多样性为进一步验证菌株留存动态可能与婴幼儿饮食结构变化相关的假设本研究对B. longum的传递特征与菌株替换模式开展了深度分析。该物种是MAMI队列婴幼儿肠道菌群中定植时间最早的类群之一表S2同时也是垂直传递占比最高的物种之一图2C且在居家分娩婴幼儿体内丰度显著升高表S2该现象大概率与这类婴幼儿更长的母乳喂养时长相关表S4。实际统计结果显示B. longum是所有物种中整体留存率最低的物种仅52%图3C出生后第一周获得的菌株在1月龄前可完全留存图3D但1~6月龄期间留存率大幅下降超过半数菌株发生替换平均留存率仅34%。值得关注的是6~12月龄期间仅剖宫产组和居家分娩组的菌株留存率出现回升超过半数菌株可稳定留存图3D。由于菌株替换事件集中发生在6月龄图3C、图4A该时间点恰好是推荐的断奶年龄本队列中绝大多数婴幼儿已不再维持纯母乳喂养6月龄纯母乳喂养占比11/3212月龄纯母乳喂养占比为0/29图S1B本研究提出假设不同B. longum菌株对饮食结构变化的适应能力存在差异。由于菌株替换从未在出生后首月发生且与分娩方式无直接关联提示菌株留存/替换的动态差异可能由不同分娩分组间的母乳喂养模式和时长差异驱动图S1B这与此前观测到的母乳喂养时长更长的婴幼儿新物种首次定植延迟的规律完全吻合。为验证该假设本研究采用基于泛基因组的系统发育分析工具PanPhlAn 3对B. longum的菌株组成进行解析该工具依托物种特异性泛基因组信息可精准识别基因的存在/缺失模式表S4。泛基因组分析结果将B. longum菌株划分为4个聚类本研究基于近缘参考基因组对其进一步完成分类鉴定图4B详见STAR方法其中2个聚类分别对应B. longumssp.longum和B. longumssp.infantis第3个聚类仅包含与B. longumspp.suillum/suis 近缘的参考基因组但该亚种未在本研究人群中检出第4个聚类仅包含本队列来源的肠道菌株无对应公开参考基因组因此将其标记为“其他亚种”。本研究还通过dbCAN2数据库对PanPhlAn分析矩阵中的基因进行CAZy家族注释详见STAR方法重点聚焦参与碳水化合物降解的糖苷水解酶GHs相关基因表S4。分析结果将糖苷水解酶划分为核心基因集和附属基因集值得关注的是绝大多数参与母乳寡糖HMO降解的酶GH18、GH20、GH29、GH33、GH85、GH95、GH112、GH136均分布在附属基因集中直接印证了B. longum的菌株替换过程与断奶阶段碳源可利用性变化相关的核心假设。为解析这些亚种的分解代谢能力本研究聚焦参与人乳寡糖HMO降解的CAZy家族包括GH18内切-β-N-乙酰葡糖胺酶、GH29α-L-岩藻糖苷酶、GH136乳-N-二糖苷酶、GH332,3-2,6-α-唾液酸酶、GH95α-1,2-L-岩藻糖苷酶等。研究发现部分具备α-L-岩藻糖苷酶和唾液酸酶活性的特定基因分别对应GH29、GH95、GH33在婴儿亚种ssp. infantis中的检出率显著高于长亚种ssp. longum费希尔精确检验OR值分别为11.32、5.73、6.53校正后P值分别为2.22e-4、2.03e-3、2.03e-3图4C表S4。‌图4Bifidobacterium longum的菌株留存特征与功能多样性随时间的动态变化为解析这些亚种的分解代谢能力本研究聚焦参与人乳寡糖HMO降解的CAZy家族包括GH18内切-β-N-乙酰葡糖胺酶、GH29α-L-岩藻糖苷酶、GH136乳-N-二糖苷酶、GH332,3-2,6-α-唾液酸酶、GH95α-1,2-L-岩藻糖苷酶等。研究发现部分具备α-L-岩藻糖苷酶和唾液酸酶活性的特定基因分别对应GH29、GH95、GH33在婴儿亚种ssp. infantis中的检出率显著高于长双歧杆菌长亚种ssp. longum费希尔精确检验OR值分别为11.32、5.73、6.53校正后P值分别为2.22e-4、2.03e-3、2.03e-3图4C表S4。此外结合亚种动态变化与CAZy基因存在情况的分析显示与长亚种菌株持续留存的情况相比长亚种菌株被婴儿亚种菌株替换的事件与GH29、GH33、GH136基因的获得显著相关费希尔精确检验OR值均为0校正后P值分别为1.5e-3、5.2e-4、2.1e-2表S4。这类CAZy基因在HMO降解过程中发挥核心作用GH29和GH33编码的岩藻糖苷酶与唾液酸酶可移除HMO上的L-岩藻糖Fuc和N-乙酰神经氨酸Neu5Ac修饰基团后续再由GH20和GH136家族编码的乳-N-二糖苷酶完成降解。由此可见婴儿亚种的HMO降解能力显著优于长亚种。进一步将这些亚种的检出情况与样本采集时间、母乳喂养模式关联分析得到两个明确规律图4D母体传递的初始菌株始终为长亚种该亚种在婴幼儿肠道中的占比随月龄增长逐步降低在6月龄时达到最低值此时菌株替换率达到峰值优势类群向婴儿亚种转变图4D。但这种高频替换现象仅在仍维持部分母乳喂养的婴幼儿体内被观测到6月龄时长亚种与其他亚种对比的费希尔精确检验OR0校正后P2.37e-312月龄时OR0.09校正后P3.52e-2图4D。整体来看不同B. longum亚种的CAZy基因库存在显著差异B. longum ssp. longum菌株携带更多不参与HMO降解的糖苷水解酶编码基因这类基因更适配混合饮食场景下的代谢需求Kruskal-Wallis检验卡方值66.3P4.1e-5与婴儿亚种、其他亚种分别进行Dunn检验的校正后P值为4.3e-10、6.47e-10图5A。本研究还同步纳入了对应母乳样本的母体分泌型状态n20STAR方法图5B与HMO代谢组谱数据结果显示B. longum ssp. longum的检出与非分泌型母亲显著相关长亚种与其他亚种对比的费希尔精确检验OR0.12P1e-3图5C。该结果提示当肠道环境中存在岩藻糖基化HMO时B. longum亚种基因组中携带的GH29和GH95酶类相比其他亚种具备明确的定植竞争优势。‌图5 | 长双歧杆菌亚种、母乳寡糖HMO谱与人群分泌型状态的关联特征‌针对该方向已有其他研究报道过母乳寡糖组成会随泌乳期发生变化。但近期一项聚焦B. longum亚种动态的研究并未发现母乳寡糖组成与特定B. longum亚种、菌株替换事件存在关联。后续开展同时覆盖婴幼儿粪便与母乳的纵向队列研究可进一步探究该问题完整阐明母乳及其组分如何驱动婴幼儿菌群的菌株替换过程。本研究结果支持以下结论纯母乳喂养或部分母乳喂养时长更长的婴幼儿其肠道菌群中适配母乳来源能源的菌株占比更高可能会延缓新的母体来源物种的定植进程。整体来看上述结果表明婴幼儿肠道内B. longum随时间发生的菌株替换过程高度依赖母乳喂养时长原有菌株发生替换时通常会从母体来源的B. longum ssp. longum向B. longum ssp. infantis或其他亚种类群转变核心原因是后者的母乳寡糖降解能力更具优势。此前针对孟加拉儿童人群的研究也发现Bifidobacterium longum的亚种替换与从纯母乳向部分母乳喂养的过渡过程相关该研究还筛选出一类特殊的B. longum菌株可同时代谢母乳来源糖类与混合膳食中的复杂碳水化合物研究人员推测该亚群可适配不同混合膳食模式且不同地理区域的菌株特征存在差异。本研究同样证实辅食引入与母乳共存的过渡喂养阶段会触发Bifidobacterium不同亚种间的替换近期一项纳入21名儿童的研究也观测到B. longum ssp. infantis在母乳喂养后期出现的现象进一步佐证了本研究结论。延迟定殖除上述核心发现外本研究也明确了多数宏基因组研究普遍存在的技术局限性针对B. longum菌株的PanPhlAn分析常提示存在多菌株混合检出的情况该场景下仅能解析优势菌株的基因组成StrainPhlAn 分析也仅能表征优势菌株的特征这是目前绝大多数宏基因组菌株检测工具的共性局限。不过近年相关技术进展已为多菌株同步检测提供了可行路径。本研究已证实初始B. longum 菌株会随时间发生替换但仍需后续分析进一步验证新菌株是完全外源获得还是饮食变化改变了优势菌株与非优势菌株的适配度最终通过相对丰度的转变被判定为菌株替换。本研究的另一项局限是样本量有限无法在统计模型中纳入更多宿主相关因素可能为分析结果引入偏倚同时1~6月龄的样本采集存在时间缺口无法解析该时段内的菌株动态变化。尽管存在上述固有局限菌株分辨率级别的宏基因组测序仍帮助本研究获得了多项围生期因素对菌群垂直传递影响的关键观测结果后续依托更大规模队列开展分析可进一步验证本研究提出的相关假设明确其对婴幼儿发育的实际意义。结论尽管分娩方式已被公认为影响生命早期微生物定植、尤其是母体菌群传递的核心围生期因素之一但出生地点、母乳喂养时长等其他因素的作用机制仍未得到充分阐明。本研究系统评估了分娩地点、分娩方式与母乳喂养时长对婴幼儿出生后首年菌群成熟过程的影响该效应在出生数月后仍可被检出不仅体现在肠道菌群组成层面更体现在菌株传递动态特征层面。本研究通过分析34对母婴队列的生命早期菌群组成与时间动态变化证实居家分娩与医院分娩的引发的差异效应在婴儿6月龄时仍显著存在此时与分娩方式相关的菌群组成差异已完全消失。此外尽管Bifidobacteriumspp.等部分物种属于组成型传递类群constitutively transmitted但分娩方式与出生地点不仅会影响大量肠道物种的传递能力还会调控其首次定植时间与后续月龄的菌株留存特征。本研究结果明确显示居家分娩新生儿比其余分组更早获得绝大多数母体菌株而剖宫产婴幼儿的多数菌株定植事件发生在6月龄之后。上述发现提示生命早期的母体菌株传递主要受分娩方式调控而出生地点则在后续月龄主导传递过程若不结合与母体选择居家分娩相关的其他关联因素该观测结果很难得到合理解释。本研究提出假设并验证MAMI队列中居家分娩婴幼儿普遍更长的母乳喂养周期是解释出生地点对6月龄以上婴幼儿菌群动态产生影响的核心因素之一。此前基于扩增子测序与培养法的研究也已证实母乳喂养及其时长是产后母体微生物传递的关键调控因子进一步支撑了本研究的假设。从更精细的机制层面来看母乳喂养时长还与Bifidobacterium longum的菌株留存率、功能多样性显著相关该物种是所有分组中垂直传递稳定性最高的类群之一且在居家分娩婴幼儿体内的检出率最高。本队列中婴幼儿首次获得的初始菌株会随喂养模式与营养物质可利用性的变化发生替换。正如本研究结果所示B. longum的菌株替换过程直接反映在母乳寡糖降解相关功能基因集的变化上对于6或12月龄仍维持部分母乳喂养的婴幼儿如本队列中的居家分娩婴幼儿人乳寡糖的可利用周期更长进一步驱动了该菌株的替换过程。上述结果提示后续需结合更多围生期因素开展菌株层面的全面动态分析目前被广泛研究的分娩方式可能只是影响生命早期菌群构建的众多因素之一。尽管剖宫产导致新生儿菌群定植延迟的作用已得到大量研究证实但现有纳入居家分娩母婴对、报道医院分娩引发新生儿菌群定植差异的研究均仅采用扩增子测序技术未开展物种水平差异、垂直传递特征或菌株替换模式的解析。针对母乳塑造婴幼儿肠道菌群的相关研究也存在同类局限人源DNA占比过高的技术难题会大幅降低宏基因组测序数据质量本研究及此前相关研究中的大量母乳样本均遇到该问题。本研究成功获得6份高质量母乳宏基因组数据明确了母乳喂养在菌群构建早期阶段的核心作用母乳中的绝大多数物种会在新生儿肠道早期定植但其检出率会随月龄增长逐步降低。尽管样本量有限但菌株共享分析证实部分母乳来源的菌株确实可在婴幼儿肠道中稳定存在。母乳宏基因组中富集口腔与皮肤来源细菌是已被报道的普遍现象不属于样本污染范畴。本研究核心目标是系统调查母婴间的菌株传递事件明确不依赖母体特定来源、仍可向新生儿转移的物种类群后续需依托更大规模队列进一步阐明该类观测结果的随机性特征与生物学意义。综上本研究结果明确提示后续开展相关研究时不能仅关注分娩方式与出生地点还需同步纳入母乳喂养时长等关键关联因素才能完整解析围生期事件对生命早期菌群发育的调控机制。