摘要福尔马林固定石蜡包埋FFPE存档组织是回顾性临床研究的宝贵资源但数10年储存对蛋白质组定量准确性的影响仍不明确。本研究采用数据非依赖采集DIA液相色谱-串联质谱技术对跨度50年的FFPE样本开展系统的10年分辨率蛋白质组学评估。研究纳入1972—2022年间约每10年间隔收集的33例胃癌病例每例样本同时显微切割肿瘤组织、配对癌旁黏膜及肌层采用标准化流程同步处理以降低技术偏差。跨越个年代的纵向分析显示可检测蛋白质组的大部分组分在定量水平保持稳定尽管储存与存档年代相关因素可造成可测量的变异但组织特异性生物学特征仍是蛋白质组图谱的主导驱动因素。其中肌层稳定性最高可作为评估存档老化的结构参照。肿瘤与非肿瘤黏膜的差异表达分析鉴定出稳定的病理学特征即便在存放50年的样本中依然可检出。尽管不同年代的蛋白可检测性存在差异但组核心差异表达蛋白及其相关功能通路包括细胞周期与代谢重编程在所有可评估年份组中均保守存在。值得注意的是1972年未接受治疗的队列可提供与当代样本深度相当的生物学信息。本研究证实长期存档储存并不会导致蛋白质组图谱丧失生物学解读价值但在分析与解读中需明确考虑储存及存档年代相关的偏移。proteomebioinformaticsgmail.com#存档稳定性 #生物标志物发现 #数据非依赖采集 #DIA #福尔马林固定石蜡包埋 #FFPE #胃癌 #长期储存 #质谱蛋白质组学 #肌层要点采用DIA蛋白质组学技术对跨度50年1972—2022年的胃癌FFPE存档样本完成了蛋白表达谱解析。经过数10年室温储存组织内绝大多数蛋白的定量水平保持稳定。肌层可作为稳定内参用于区分储存相关效应与真实生物学差异。细胞周期、代谢重编程等肿瘤核心通路的信号在跨年代样本中均保守存在。本研究为利用多年代临床FFPE存档样本开展回顾性生物标志物发现提供了方法框架。材料与方法患者队列与样本筛选表1临床病理信息组织学类型依据「胃癌日本分类标准」划分MUC为黏液腺癌POR为低分化腺癌POR1为实体型低分化腺癌POR2为非实体型低分化腺癌TUB为管状腺癌TUB1为高分化管状腺癌TUB2为中分化管状腺癌。肿瘤部位依据「胃癌日本分类标准」划分A为吻合口C为贲门D为12指肠DL为12指肠至下部1/3L为下部1/3LMU为下部1/3主病灶延伸至中部及上部1/3M为中部1/3ML为中部1/3主病灶延伸至下部1/3MU为中部1/3主病灶延伸至上部1/3MUL为中部1/3主病灶延伸至上、下部1/3U为上部1/3UM为上部1/3主病灶延伸至中部1/3组合标注中首字母代表肿瘤原发部位。pT为病理肿瘤分期肿瘤浸润深度依据TNM分期划分pT3为肿瘤侵及浆膜下结缔组织pT4为肿瘤侵及浆膜脏层腹膜或邻近结构。n为患者例数IQR为4分位距连续变量以中位数[4分位距]表示。结果10年分辨率的蛋白丰度与蛋白质组稳定性图16个年份组1972–2022蛋白质组的长期稳定性与变异性(A) 肌层、肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织中按年份分组的蛋白表达轨迹。组织特异性蛋白集合定义为在每个年份组内至少50%的样本中可定量且在全部6个收集年份组1972、1982、1992、2002、2012、2022均满足该标准的蛋白。对每个蛋白计算各年份组的中位值并通过减去所有组的均值进行中心化处理。可视化展示代表性子集高变异性年份组中位数的log₂范围≥1与低变异性log₂范围 1随机抽样蛋白各最多120个。队列层面的汇总统计量中位数与4分位距基于对应蛋白集合中的全部蛋白计算。(B) 同一蛋白集合的log₂转化蛋白强度热图按行归一化以凸显各年份组与样本间的相对表达模式。缺失值仅用于可视化时采用行中位数填充不用于统计推断。(C) 每个样本的总蛋白丰度长期趋势计算方式为A、B所用同一蛋白集合的线性尺度强度之和按年份组汇总均值±标准差。(D) 基于同一蛋白集合的全局蛋白质组结构主成分分析PCA展示前2个主成分。肿瘤与非肿瘤组织的差异蛋白质组特征图2不同年份肿瘤与癌旁非肿瘤组织的差异蛋白丰度(A) 6个收集年份组合并分析的火山图展示肿瘤与癌旁非肿瘤组织的差异表达蛋白DEP。蛋白丰度经log₂转化后采用limma包分析将收集年份组作为协变量纳入模型。检验对象为合并数据集中肿瘤与非肿瘤组中均至少50%样本可定量的蛋白。横轴为log₂倍数变化肿瘤/非肿瘤纵轴为−log₁₀(FDR)。达到预设显著性与效应量阈值的蛋白以高亮标注红色为肿瘤中上调蓝色为肿瘤中下调。(B–G) 按年份组分层分析的火山图分别对应1970年代 (B)、1980年代(C)、1990年代(D)、2000年代(E)、2010年代(F)、2020年代(G)样本。每个年份组内独立采用limma评估肿瘤与癌旁非肿瘤组织的差异丰度检验限定为该年份组内肿瘤与非肿瘤组均至少50%样本可定量的蛋白。坐标轴与颜色编码同图A灰色点为未达到显著性标准的蛋白。个可评估年份组间差异表达蛋白的一致性与保守性图3 不同年份差异表达蛋白的一致性(A) 韦恩图展示剔除统计效力不足的1982年组后按年份组分层的肿瘤-癌旁非肿瘤差异表达蛋白的重叠情况。上调左与下调右蛋白分开展示。每个年份组的差异表达分析采用limma限定为对应年份组内2种组织均至少 50% 样本可定量的蛋白。数字标注对应年份组间共享的差异表达蛋白数量。(B) 6个年份组合并分析鉴定的差异表达蛋白与5个可评估年份组分层分析共有差异表达蛋白的对比。外圈代表6个年份组合并分析检出的差异表达蛋白内圈代表5个可评估年份组分层分析共有的差异表达蛋白子集。上调左与下调右蛋白分开展示。功能富集与通路层面解读图4 不同年份肿瘤-正常组织差异相关的Hallmark通路富集(A) 基于年份组分层肿瘤-癌旁非肿瘤对比得到的差异表达蛋白对MSigDB Hallmark基因集进行过表达分析ORA。结果按肿瘤中上调左红色与下调右蓝色蛋白分开展示。ORA针对重叠分析纳入的5个可评估年份组1972、1992、2002、2012、2022独立开展统计效力不足的1982年组因仅检出1个差异表达蛋白未纳入年份组特异性ORA分析。每次分析中差异表达蛋白通过limma鉴定限定为对应年份组内2种组织均至少50%样本可定量的蛋白。ORA的背景基因集为对应limma分析中全部受检蛋白。点状图展示按错误发现率FDR排序的Top富集通路横轴为富集倍数基因占比/背景占比点大小代表通路纳入基因数点颜色代表−log₁₀(FDR)。(B) 6个年份组合并的肿瘤-非肿瘤分析ORA结果limma模型中纳入收集年份组作为协变量。差异表达蛋白定义为合并数据集中肿瘤与非肿瘤组均至少50%样本可定量的蛋白。富集结果按肿瘤中上调左与下调右分开展示可视化与统计定义同图A。数据已通过jPOST数据存储库提交至ProteomeXchange联盟数据集标识号为JPST004410PXD074469详细总结思维导图各年代组差异表达蛋白DEP数量参考Proteomics. 2026 Jun 27:e70161. doi: 10.1002/pmic.70161.Decade-Resolved Proteomic Profiling of Gastric Cancer FFPE Archives: Evaluating Storage-Associated Shifts and Signal Stability Over 50 Years注AI辅助创作如有不当欢迎指出。内容仅供参考不构成任何建议。