摘要抗微生物药物耐药性antimicrobial resistance, AMR对全球公共卫生构成重大威胁。移动微生物学实验室能够在地理偏远和资源有限的地区如加拉帕戈斯群岛开展 AMR 环境监测。本研究报道了一种用于在圣克里斯托瓦尔岛San Cristóbal周边海域开展 AMR 监测的移动实验室的开发与应用该岛是加拉帕戈斯群岛中人口第二多的岛屿近年来经历了快速城市化和高强度国际旅游压力。对受污水污染的海洋站点开展的现场宏基因组测序显示与非污染海洋站点相比微生物属组成发生显著改变且 AMR 基因数量更高其模式与当地未经处理的生活污水的宏基因组结果相吻合。在污水排放口附近的污水或海洋环境中直接分离的乳糖发酵肠杆菌科lactose-fermenting Enterobacteriaceae分离株中超过 40% 表现出多重耐药multidrug resistance, MDR表型。对 MDR 大肠杆菌Escherichia coli开展长读长测序并进行质粒从头组装表明AMR 基因在质粒上频繁且快速地重排从而在岛上产生多样化且具有功能的耐药组resistome。本研究不仅为在资源有限环境下开展 AMR 研究提供了框架也凸显了污水污染对环境 AMR 格局的影响并提示了对人类和动物健康的潜在威胁。Keywords抗微生物药物耐药性加拉帕戈斯群岛移动实验室污水污染宏基因组学长读长测序质粒重排大肠杆菌One Health文献信息Lal, A., Riopelle, J. C., Villarin, K., Mathur, M., Enriquez, L., Xiao, R., Phemister-Jimenez, N., Gilbert, K., Cole, S. D., Tilyou, M., Kennedy, K. P., Vaca, E., Castillo, W., Weisberg, M., Mattei, L. M., Beiting, D. P. (2026). Human wastewater contamination drives the emergence of multidrug-resistant bacteria in the Galápagos marine ecosystem.Nature Communications, 17, 7601. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74899-9期刊Nature CommunicationsIF 18.1在线发表2026 年 8 月 4 日研究总结加拉帕戈斯污水驱动MDR细菌涌现研究背景圣克里斯托瓦尔岛污水处理厂超负荷旅游与城市化加剧污水排放偏远地区AMR监测能力不足技术平台移动微生物学实验室便携qPCR检测人源粪便标记牛津纳米孔长读长测序核心发现污水排放点微生物群落显著偏移耐药组丰富且以质粒携带为主肠杆菌分离株MDR比例超过40%质粒快速重排产生新型MDR组合科学与政策意义印证One Health视角下的AMR风险为资源有限地区提供监测范式提示需升级污水基础设施背景介绍AMR 已被列为全球公共卫生的重大威胁2021 年细菌耐药性关联死亡约 500 万例占全球死亡总数的 9%预计到 2050 年负担将翻倍。在低收入和中等收入国家LMICs由于监测与废物管理基础设施不足、疫苗接种率低、城市化快速推进以及抗菌药物滥用等因素AMR 的影响尤为严重。加拉帕戈斯群岛是研究人类活动如何影响海洋生态系统 AMR 涌现与演化的天然实验室。圣克里斯托瓦尔岛是群岛中唯一拥有功能性污水处理厂wastewater treatment plant, WWTP的岛屿该系统建于 1982 年约 2012 年全面运行采用合流式溢流combined sewer overflow设计依靠三个泵站将海平面高度的居民区_raw sewage_ 抽升至高处的 WWTP。然而随着岛上人口过去数十年增长四倍系统长期超负荷并频发机械故障。2019 年 8 月至 2020 年 12 月间WWTP 故障导致超 60 万立方米未处理污水排入周边海岸水体。2020 年的研究显示尽管该 WWTP 对氨氮、磷酸盐等污染物的去除达到厄瓜多尔排放标准但对总大肠菌群和大肠杆菌E. coli无任何去除效果出水大肠杆菌计数超标 25 倍。尽管存在这些特殊情况未处理污水污染对加拉帕戈斯海洋环境的影响仍知之甚少。本研究旨在开发一种移动微生物学实验室以识别未处理污水污染位点并将细菌分类群、AMR 基因与耐药表型联系起来从而在资源有限的环境下开展多模态 AMR 监测。重要结果结果1持续污水污染位点的识别作者开发并优化了一套移动微生物学野外实验室可在无可靠冷链和连续供电的条件下运行。通过对 16 个海洋站点、2 个淡水站点和 2 个市政污水处理系统站位为期两年的采样结合现场冻干三重 qPCR 检测通用粪便标记Enterococcus faecalis与人源特异性标记HF183来源于 Bacteroides dorei 16S rRNA作者明确了人类粪便污染的空间与时间分布。Figure 1 图注移动 AMR 发现平台。无菌袋采集的海水样本通过三个工作流之一进行处理每个工作流均强调现场适用检测与便携式设备A 用于检测人类粪便污染的 qPCRB 对海洋生态系统或市政排污系统中的乳糖发酵肠杆菌科分离株进行 AMR 分析C 对海水、污水或大肠杆菌分离株进行长读长测序。工作流 A-C 的耗材与设备及其费用详见补充数据 1。图使用矢量图形编辑器 Sketch 创建。Figure 2 图注B 散点图点的大小表示两年期间采集的样本数量颜色表示人源粪便 qPCR 检测的相对荧光单位RFUC 点阵图显示 13 个站点在两年的时间里的 qPCR 检测结果每个点代表一次采样事件。地图使用 ArcGIS 软件与 Esri Outdoor 底图创建。最强的 qPCR 信号出现在 Punta Carola Pipe 站点——该处名义上是处理污水排放口但已被证实也是未处理污水的排放点。Playa de Oro、Muelle de Pespadores 和 Laguna 等靠近泵站与溢流口的站点亦呈现高水平人源粪便信号且信号强度随季节与年份波动。进一步使用 MC-Media Pad 干式培养系统计数活菌证实这些位点存在 3000 CFU/mL 的大肠杆菌与大肠菌群表明 qPCR 阳性位点同时存在具有活性的粪便指示菌。结果2宏基因组测序鉴定人源粪便污染物为揭示污水污染对海洋微生物多样性的广泛影响并详细检视微生物基因如 AMR 基因作者对 2022 年与 2023 年夏季采集的 10 个样本进行了长读长宏基因组分析同时对市政合流污水溢流系统中的 2 个未处理污水样本直接采样。纳米孔测序平均每个样本产生 4.42×10⁶ 条 reads平均读长 1460 bpN50 中位数 6197 bp平均产出 12×10⁹ bp。基于属水平分类丰度的聚类分析将站点划分为两大群组。第一组包括相对偏远的 Playa Baquerizo、无人岛 Española、市内常用海滩 Playa Mann 以及 2023 年的 Muelle de Pescadores 样本其优势类群为海洋典型类群聚球藻 Synechococcus、原绿球藻 Prochlorococcus、硅藻 Chaetoceros、海洋异养菌 Planktomarina、Pseudoalteromonas、Alteromonas、弧菌 Vibrio 等肠道微生物极少表明这些站点基本未受未处理污水影响。值得注意的是位于市中心的 Playa Mann 分类学轮廓与偏远站点相似说明单纯的人类游憩活动不足以构成粪便污染来源。第二组则由污水关联站点主导包括两个污水样本、靠近未处理污水排放口的 Punta Carola Pipe 与 Laguna以及 2022 年的 Muelle de Pespadores 样本。这些位点的优势类群为肠道来源属弓形菌 Arcobacter、拟杆菌 Bacteroides、双歧杆菌 Bifidobacterium、梭菌 Clostridium、大肠杆菌 Escherichia、链球菌 Streptococcus及环境菌假单胞菌 Pseudomonas、不动杆菌 Acinetobacter。海洋排放口附近海水与市政污水系统在分类学轮廓上的相似性连同 qPCR 与 CFU 结果有力支持了这些位点受到未处理污水污染的论断。Figure 3 图注A 基于属水平分类丰度顶部树状图与 AMR 基因底部树状图的层次聚类热图。在 500 bp 的重叠群中使用 AMRFinderPlus 检测的 AMR 基因。列通过 Jaccard 距离的加权平均连锁层次聚类进行聚类。左侧与下方的颜色分别表示 AMR 基因类别和采样站点类别。C 显示总 AMR 基因密度D 按 AMR 基因耐药类别分列的 AMR 密度以每 10 Mb 组装重叠群长度中的 AMR 基因数表示。结果3污水关联位点检测到多样化的耐药组作者在长读长宏基因组数据中检测到跨越 9 个抗菌药物大类的 94 个耐药基因。AMR 基因密度最高的为污水样本重叠群其次为 Punta Carola 排放口位点而其他位点则含极少或无 AMR 基因。按耐药类别分列的 AMR 基因密度分析揭示了 Punta Carola Pipe 与两个污水位点之间的高度相似性包括四环素类、β-内酰胺类和大环内酯类等耐药基因的较强存在。2022 年 Muelle de Pespadores 样本而非 2023 年样本与 Laguna 样本也观察到同类别但水平较低的 AMR 基因。这些数据提示受污水污染影响的位点可能也是环境中 AMR 的来源。结果4环境大肠菌群的 AMR 表型分析鉴于宏基因组中 AMR 基因的存在并不一定反映实际的耐药能力作者进一步对从岛周海洋生态系统中回收的细菌进行 AMR 表型测定。研究聚焦于乳糖发酵肠杆菌科主要为大肠杆菌因其易于从 MC-Media Pad 上传代培养且是潜在的人畜病原体。作者从淡水、海水、排放口位点或未处理污水中累计培养了 183 株乳糖发酵肠杆菌科分离株并使用 Kirby-Bauer 纸片扩散法针对 12 种临床相关抗生素进行耐药评估。Figure 4 图注A 市政污水与疑似或未处理污水排放口附近的海洋站点之间针对每种抗生素的耐药分离株比例。抗生素类别缩写为AMC 阿莫西林/克拉维酸AMP 氨苄青霉素AZM 阿奇霉素C 氯霉素CIP 环丙沙星CN 庆大霉素CRO 头孢曲松FOX 头孢西丁MEM 美罗培南S 链霉素SXT 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑TE 四环素。B 堆叠条形图上与 “Upset” 图下显示不同抗生素耐药组合的分离株数量与站点类别。星号表示符合 MDR 标准的 AMR 组合。在非污水位点回收的分离株中仅观察到 3 株满足 MDR 定义即对三类及以上不同类别抗生素耐药。相比之下污水排放口附近的海洋站点分离株中有 26/68 株38.2%为 MDR污水样本中 35/84 株41.7%为 MDR。64 株 MDR 分离株共呈现出 50 种独特的耐药谱。除氨苄青霉素与四环素耐药见于大多数 MDR 分离株外大量独特的 MDR 组合暗示了无法仅用少数独立耐药谱系传播来解释的遗传多样性。部分污水与排放口分离株对六类及以上抗生素呈现表型耐药。此外作者观察到 3 株携带对美罗培南meropenem表型耐药的独特菌株——鉴于世界卫生组织WHO已将碳青霉烯类耐药肠杆菌包括大肠杆菌列为重点优先级细菌病原体这一发现尤为值得关注。结果5抗微生物耐药大肠杆菌的系统基因组分析为探索岛周污水、排放口及在较小程度上海水中 MDR 的基因组基础作者选取了 183 株乳糖发酵肠杆菌科分离株中具有 AMR 表型的 53 株进行长读长测序主要关注 MDR 分离株。经过滤低质量组装后45 个高质量组装均产生了完整的无间隙细菌基因组其中 37 个至少包含一个完整质粒。基于 Clermont 分型与多位点序列分型multi-locus sequence typing, MLST的分析鉴定出 5 个不同的系统发育组A 组21 株人畜共生、B1 组15 株环境与动物相关、B2 组1 株高毒力人源相关、D 组5 株更强毒力的肠外病原体、E 组2 株与 D 组相关与食源性暴发相关以及 G 组1 株。值得注意的是分析发现了若干全球分布的、与 MDR 相关的高风险大流行克隆包括 ST10、ST58、ST69 和 ST155。Figure 5 图注45 株大肠杆菌分离株的染色体与质粒图谱。左侧为基于单拷贝基因构建的系统发育树Clermont 分型与 ST 序列型标注于旁。中间为组装的染色体与质粒图谱按大小降序排列。右侧热图显示各分离株的 AMR 基因检测结果深色热图。顶部星号表示主要在基因组中观察到的 AMR 基因。顶部带圈叉号表示带有定点突变的 AMR 基因。左侧红色标识符表示 D 组 MDR 大肠杆菌克隆详见图 6。染色体上几乎普遍存在多重耐药外排基因与喹诺酮耐药基因如 acr(E/F/S)、mdt(E/F/H/M/N/O/P)、emr(E/R)、evg(A/S)而氨基糖苷类、四环素类、磺胺类或大环内酯类的 AMR 基因几乎完全定位于质粒。这一发现凸显了长读长测序与质粒从头组装在 AMR 基因发现中的重要性。一组系统发育相关的 D 组 MDR 分离株PCP07014、SW070912、SW070910、SW071620 和 PCP06238尤其引人担忧——其中三株经 MLST 分析归属于 ST69 复合群这是与肠外感染包括尿路感染相关的全球大流行大肠杆菌谱系。所有 D 组分离株均来自污水或在 Punta Carola 排放口附近的海洋环境中分离获得且均在相同的三周时间内分离从而直接将污水污染与海洋环境中 MDR 的涌现联系起来。结果6D 组大肠杆菌的菌株水平分析鉴于 D 组分离株的致病潜力与巨大 AMR 负担作者针对 SW070912、SW070910、SW071620、PCP07014 和 PCP06238 开展了泛基因组分析。五株菌的泛基因组由 3483 个核心基因簇与 1354 个附属基因簇组成任意两株菌的核心基因组 SNP 差异不超过 300 个。从同一市政污水系统中相隔一周分离的两株 MDR 菌株 SW070910 与 SW071620 享有近乎相同的核心与附属基因组前者仅相差 150 个 SNP全基因组比对显示二者共线性良好除 SW070910 中一段 469 Kb 区域相对 SW071620 发生倒位外。Figure 6 图注A 五株 D 组 MDR 大肠杆菌的泛基因组分析核心基因簇与附属基因簇分别展示。B SW070910 与 SW071620 的质粒图谱质粒按大小降序标注P1最大。C SW071620 的 P4 与 SW070910 的 P2 等质粒的同线性比较可见 SW071620 的 P1 与 SW070910 超过 200 Kb 的接合 mega-质粒 P1 完全同线SW071620 的 P3 与 SW070910 P1 部分同线提示质粒正在发生融合或裂变。D SW070910 的 P1 质粒与 SW071620 的 P1、P3 质粒的相关性热图热图颜色强度反映 Jaccard 相似指数注释显示 AMR 基因定位于质粒中保守性有限或较差的区域。两株菌的质粒内容比较揭示了显著的质粒洗牌现象SW070910 与 SW071620 分别产生 4 个和 5 个全长质粒。接合性质粒 SW071620 的 P4 与 SW070910 的 P2 长度相近且高度同线可 mobilizable 质粒 SW071620 的 P1 在其 107 Kb 全长上与 SW070910 超过 200 Kb 的接合 mega-质粒 P1 完全同线SW071620 的接合性质粒 P3 则与 SW070910 P1 在约 50 Kb 长度上同线。这些结果表明这些质粒在不同细菌菌株中可能正在经历融合与/或裂变从而导致株内质粒异质性。为进一步评估质粒洗牌对 AMR 基因多样性的贡献作者将 mega-质粒与两个较小的同线性质粒与涵盖 40,757 个全球分布质粒的数据库进行 BLAST 比对并构建相关性矩阵热图。分析显示除少数小区室外SW071620 P3 质粒四分之三的连续区域在数据库中可被观察到代表了无 AMR 基因的稳定的质粒骨架SW071620 P1 包含一段约 20 Kb 的保守插入AMR 基因定位于保守性极小的区域提示这些基因为近期获得而在 mega-质粒中AMR 基因落于既不与质粒通用骨架也不与其他携带 AMR 基因区域相关联的区段。这表明导致 MDR 的 AMR 基因组合是在质粒中新近形成的并未与完全保守的基因盒或稳定质粒骨架谱系相耦合。由于携带这些质粒的细菌从可通达海洋环境的市政污水中分离获得这些质粒有可能导致对抗生素治疗无效的致病性大肠杆菌感染从而对动物或人类健康造成显著的发病与死亡风险。方法学参考本研究的方法学体系可概括为以下现场多模态工作流相关标准操作流程SOP已在 https://protocols.hostmicrobe.org/field-amr-sops 公开。现场水样采集无菌Whirl-Pak袋/有机棉塞现场过滤与DNA提取0.2μm硝酸纤维素膜Biomeme免离心试剂盒便携qPCR检测人源粪便Franklin thermocycler Biomeme Go AppMC-Media Pad培养活菌37°C 18-24h计数CFUMacConkey II平板传代筛选乳糖发酵肠杆菌科Kirby-Bauer纸片扩散法12种抗生素耐药表型纳米孔宏基因组测序MinION LSK110大肠杆菌分离株长读长全基因组测序MinION NBD114.24Flye组装 racon/medaka抛光AMRFinderPlus预测耐药基因Autocycler多汇编器共识组装Clermont分型 MLST AMR注释质粒同线性与全球质粒库BLAST比对Jaccard相似性分析可供同行借鉴的关键技术要点包括免冷链 DNA 提取使用 Biomeme M1 预填充试剂 cartridge 与注射器式提取柱无需移液器与离心机冻干 qPCR 反应Biomeme BioPoo Enterococcus Panel Go-Strips 三重探针 qPCR智能手机控制便携热循环仪干式培养系统MC-Media Pad 替代传统琼脂平板无需培养基制备长读长宏基因组纳米孔 MinION 配合 Flye 元组装、proovframe 移码校正、AMRFinderPlus 耐药基因预测菌株级质粒解析Autocycler 整合 flye/miniasm/raven 多汇编器输出实现无间隙基因组与完整质粒组装全球质粒库比对将组装质粒与 40,757 个全球质粒数据库进行 BLAST以 Jaccard 相似指数可视化质粒骨架保守性与 AMR 基因插入 novelty总结本研究针对圣克里斯托瓦尔岛污水处理厂长期超负荷运行、频繁将未处理污水排入 Puerto Baquerizo Moreno 周边海域的现实问题开发了一套多模态移动微生物学实验室。通过现场 qPCR 定位人类粪便污染热点结合长读长宏基因组测序与分离株表型/基因型分析研究取得以下核心结论第一污水排放口附近的海洋微生物群落发生根本性转变其分类学轮廓与市政未处理污水高度相似且 AMR 基因密度显著高于非污染海洋站点跨 9 个抗菌药物大类共检测到 94 个耐药基因。第二在污水与排放口附近的乳糖发酵肠杆菌科分离株中MDR 比例超过 40%污水 41.7%排放口附近海洋 38.2%远高于非污染位点仅 3 株 MDR。64 株 MDR 分离株呈现出 50 种独特耐药谱并检出 3 株对最后防线抗生素美罗培南耐药的分离株。第三系统基因组分析揭示MDR 表型的多样性主要由质粒而非染色体驱动——氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、大环内酯类等 AMR 基因几乎完全定位于质粒。对 D 组 MDR 大肠杆菌的深入分析表明AMR 基因在质粒骨架上频繁发生重排与重组形成并非由完全保守基因盒或稳定质粒谱系承载的新型 MDR 组合。这种基于质粒的快速洗牌机制解释了加拉帕戈斯岛 MDR 表型的高度动态性与新颖性。第四研究发现的 ST10、ST58、ST69、ST155 等均是全球分布的高风险大流行克隆其中 ST69 复合群与肠外感染密切相关。所有 D 组 MDR 分离株均在相同三周时间内从污水或 Punta Carola 排放口附近海洋环境中分离获得直接将污水污染与海洋 MDR 涌现联系起来。本研究不仅为资源有限环境下的 AMR 监测提供了可复制的范式——便携式智能手机驱动 qPCR、即用型冻干 qPCR 反应、MC-Media Pad 细菌分离等技术消除了耗时且易出错的操作步骤降低了对熟练技术人员的依赖为当地利益相关方参与监测工作打开了大门同时也强调了将 AMR 视为 One Health 挑战的重要性。圣克里斯托瓦尔岛周边海域栖息着群岛中浓度最高的加拉帕戈斯海狮Zalophus wollebaeki种群人类与海狮的密切互动为 MDR 大肠杆菌在海洋哺乳动物中的定植与扩散提供了途径可能对这一濒危物种的健康构成威胁。研究指出遏制 AMR 跨生态系统传播对 One Health 至关重要但这需要深入理解复杂微生物环境中 MDR 菌株与质粒涌现的机制。作者亦坦承移动 AMR 实验室的局限性便携 qPCR 与纳米孔测序仪器相对昂贵、培养工作仍依赖传统琼脂平板、生物信息学分析未能在现场完成等。未来可通过 Redigel 系统、Sensititre MIC 系统、便携式 GPU 加速现场分析、纳米孔碱基修饰检测与适应性测序等手段进一步优化。最终这项研究为加拉帕戈斯群岛的 AMR 风险评估与污水基础设施现代化升级提供了直接的科学支撑证明了移动微生物学实验室作为全球 AMR 监测模型在指导政策、公共工程与临床决策方面的强大潜力。参考文献Lal, A., Riopelle, J. C., Villarin, K., et al. (2026). Human wastewater contamination drives the emergence of multidrug-resistant bacteria in the Galápagos marine ecosystem.Nature Communications, 17, 7601. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74899-9现场 AMR 实验室标准操作流程https://protocols.hostmicrobe.org/field-amr-sops数据分析代码仓库https://github.com/ruicatxiao/GERA宏基因组测序数据Sequence Read Archive 登录号 PRJNA1320681大肠杆菌分离株全基因组测序数据Sequence Read Archive 登录号 PRJNA1320685加拉帕戈斯国家公园 2024 年关于圣克里斯托瓦尔岛海滩污染的制裁程序公告https://galapagos.gob.ec/comunicado-oficial-2/ NC｜人类污水污染驱动加拉帕戈斯海洋生态系统中多重耐药细菌的出现
摘要抗微生物药物耐药性antimicrobial resistance, AMR对全球公共卫生构成重大威胁。移动微生物学实验室能够在地理偏远和资源有限的地区如加拉帕戈斯群岛开展 AMR 环境监测。本研究报道了一种用于在圣克里斯托瓦尔岛San Cristóbal周边海域开展 AMR 监测的移动实验室的开发与应用该岛是加拉帕戈斯群岛中人口第二多的岛屿近年来经历了快速城市化和高强度国际旅游压力。对受污水污染的海洋站点开展的现场宏基因组测序显示与非污染海洋站点相比微生物属组成发生显著改变且 AMR 基因数量更高其模式与当地未经处理的生活污水的宏基因组结果相吻合。在污水排放口附近的污水或海洋环境中直接分离的乳糖发酵肠杆菌科lactose-fermenting Enterobacteriaceae分离株中超过 40% 表现出多重耐药multidrug resistance, MDR表型。对 MDR 大肠杆菌Escherichia coli开展长读长测序并进行质粒从头组装表明AMR 基因在质粒上频繁且快速地重排从而在岛上产生多样化且具有功能的耐药组resistome。本研究不仅为在资源有限环境下开展 AMR 研究提供了框架也凸显了污水污染对环境 AMR 格局的影响并提示了对人类和动物健康的潜在威胁。Keywords抗微生物药物耐药性加拉帕戈斯群岛移动实验室污水污染宏基因组学长读长测序质粒重排大肠杆菌One Health文献信息Lal, A., Riopelle, J. C., Villarin, K., Mathur, M., Enriquez, L., Xiao, R., Phemister-Jimenez, N., Gilbert, K., Cole, S. D., Tilyou, M., Kennedy, K. P., Vaca, E., Castillo, W., Weisberg, M., Mattei, L. M., Beiting, D. P. (2026). Human wastewater contamination drives the emergence of multidrug-resistant bacteria in the Galápagos marine ecosystem.Nature Communications, 17, 7601. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74899-9期刊Nature CommunicationsIF 18.1在线发表2026 年 8 月 4 日研究总结加拉帕戈斯污水驱动MDR细菌涌现研究背景圣克里斯托瓦尔岛污水处理厂超负荷旅游与城市化加剧污水排放偏远地区AMR监测能力不足技术平台移动微生物学实验室便携qPCR检测人源粪便标记牛津纳米孔长读长测序核心发现污水排放点微生物群落显著偏移耐药组丰富且以质粒携带为主肠杆菌分离株MDR比例超过40%质粒快速重排产生新型MDR组合科学与政策意义印证One Health视角下的AMR风险为资源有限地区提供监测范式提示需升级污水基础设施背景介绍AMR 已被列为全球公共卫生的重大威胁2021 年细菌耐药性关联死亡约 500 万例占全球死亡总数的 9%预计到 2050 年负担将翻倍。在低收入和中等收入国家LMICs由于监测与废物管理基础设施不足、疫苗接种率低、城市化快速推进以及抗菌药物滥用等因素AMR 的影响尤为严重。加拉帕戈斯群岛是研究人类活动如何影响海洋生态系统 AMR 涌现与演化的天然实验室。圣克里斯托瓦尔岛是群岛中唯一拥有功能性污水处理厂wastewater treatment plant, WWTP的岛屿该系统建于 1982 年约 2012 年全面运行采用合流式溢流combined sewer overflow设计依靠三个泵站将海平面高度的居民区_raw sewage_ 抽升至高处的 WWTP。然而随着岛上人口过去数十年增长四倍系统长期超负荷并频发机械故障。2019 年 8 月至 2020 年 12 月间WWTP 故障导致超 60 万立方米未处理污水排入周边海岸水体。2020 年的研究显示尽管该 WWTP 对氨氮、磷酸盐等污染物的去除达到厄瓜多尔排放标准但对总大肠菌群和大肠杆菌E. coli无任何去除效果出水大肠杆菌计数超标 25 倍。尽管存在这些特殊情况未处理污水污染对加拉帕戈斯海洋环境的影响仍知之甚少。本研究旨在开发一种移动微生物学实验室以识别未处理污水污染位点并将细菌分类群、AMR 基因与耐药表型联系起来从而在资源有限的环境下开展多模态 AMR 监测。重要结果结果1持续污水污染位点的识别作者开发并优化了一套移动微生物学野外实验室可在无可靠冷链和连续供电的条件下运行。通过对 16 个海洋站点、2 个淡水站点和 2 个市政污水处理系统站位为期两年的采样结合现场冻干三重 qPCR 检测通用粪便标记Enterococcus faecalis与人源特异性标记HF183来源于 Bacteroides dorei 16S rRNA作者明确了人类粪便污染的空间与时间分布。Figure 1 图注移动 AMR 发现平台。无菌袋采集的海水样本通过三个工作流之一进行处理每个工作流均强调现场适用检测与便携式设备A 用于检测人类粪便污染的 qPCRB 对海洋生态系统或市政排污系统中的乳糖发酵肠杆菌科分离株进行 AMR 分析C 对海水、污水或大肠杆菌分离株进行长读长测序。工作流 A-C 的耗材与设备及其费用详见补充数据 1。图使用矢量图形编辑器 Sketch 创建。Figure 2 图注B 散点图点的大小表示两年期间采集的样本数量颜色表示人源粪便 qPCR 检测的相对荧光单位RFUC 点阵图显示 13 个站点在两年的时间里的 qPCR 检测结果每个点代表一次采样事件。地图使用 ArcGIS 软件与 Esri Outdoor 底图创建。最强的 qPCR 信号出现在 Punta Carola Pipe 站点——该处名义上是处理污水排放口但已被证实也是未处理污水的排放点。Playa de Oro、Muelle de Pespadores 和 Laguna 等靠近泵站与溢流口的站点亦呈现高水平人源粪便信号且信号强度随季节与年份波动。进一步使用 MC-Media Pad 干式培养系统计数活菌证实这些位点存在 3000 CFU/mL 的大肠杆菌与大肠菌群表明 qPCR 阳性位点同时存在具有活性的粪便指示菌。结果2宏基因组测序鉴定人源粪便污染物为揭示污水污染对海洋微生物多样性的广泛影响并详细检视微生物基因如 AMR 基因作者对 2022 年与 2023 年夏季采集的 10 个样本进行了长读长宏基因组分析同时对市政合流污水溢流系统中的 2 个未处理污水样本直接采样。纳米孔测序平均每个样本产生 4.42×10⁶ 条 reads平均读长 1460 bpN50 中位数 6197 bp平均产出 12×10⁹ bp。基于属水平分类丰度的聚类分析将站点划分为两大群组。第一组包括相对偏远的 Playa Baquerizo、无人岛 Española、市内常用海滩 Playa Mann 以及 2023 年的 Muelle de Pescadores 样本其优势类群为海洋典型类群聚球藻 Synechococcus、原绿球藻 Prochlorococcus、硅藻 Chaetoceros、海洋异养菌 Planktomarina、Pseudoalteromonas、Alteromonas、弧菌 Vibrio 等肠道微生物极少表明这些站点基本未受未处理污水影响。值得注意的是位于市中心的 Playa Mann 分类学轮廓与偏远站点相似说明单纯的人类游憩活动不足以构成粪便污染来源。第二组则由污水关联站点主导包括两个污水样本、靠近未处理污水排放口的 Punta Carola Pipe 与 Laguna以及 2022 年的 Muelle de Pespadores 样本。这些位点的优势类群为肠道来源属弓形菌 Arcobacter、拟杆菌 Bacteroides、双歧杆菌 Bifidobacterium、梭菌 Clostridium、大肠杆菌 Escherichia、链球菌 Streptococcus及环境菌假单胞菌 Pseudomonas、不动杆菌 Acinetobacter。海洋排放口附近海水与市政污水系统在分类学轮廓上的相似性连同 qPCR 与 CFU 结果有力支持了这些位点受到未处理污水污染的论断。Figure 3 图注A 基于属水平分类丰度顶部树状图与 AMR 基因底部树状图的层次聚类热图。在 500 bp 的重叠群中使用 AMRFinderPlus 检测的 AMR 基因。列通过 Jaccard 距离的加权平均连锁层次聚类进行聚类。左侧与下方的颜色分别表示 AMR 基因类别和采样站点类别。C 显示总 AMR 基因密度D 按 AMR 基因耐药类别分列的 AMR 密度以每 10 Mb 组装重叠群长度中的 AMR 基因数表示。结果3污水关联位点检测到多样化的耐药组作者在长读长宏基因组数据中检测到跨越 9 个抗菌药物大类的 94 个耐药基因。AMR 基因密度最高的为污水样本重叠群其次为 Punta Carola 排放口位点而其他位点则含极少或无 AMR 基因。按耐药类别分列的 AMR 基因密度分析揭示了 Punta Carola Pipe 与两个污水位点之间的高度相似性包括四环素类、β-内酰胺类和大环内酯类等耐药基因的较强存在。2022 年 Muelle de Pespadores 样本而非 2023 年样本与 Laguna 样本也观察到同类别但水平较低的 AMR 基因。这些数据提示受污水污染影响的位点可能也是环境中 AMR 的来源。结果4环境大肠菌群的 AMR 表型分析鉴于宏基因组中 AMR 基因的存在并不一定反映实际的耐药能力作者进一步对从岛周海洋生态系统中回收的细菌进行 AMR 表型测定。研究聚焦于乳糖发酵肠杆菌科主要为大肠杆菌因其易于从 MC-Media Pad 上传代培养且是潜在的人畜病原体。作者从淡水、海水、排放口位点或未处理污水中累计培养了 183 株乳糖发酵肠杆菌科分离株并使用 Kirby-Bauer 纸片扩散法针对 12 种临床相关抗生素进行耐药评估。Figure 4 图注A 市政污水与疑似或未处理污水排放口附近的海洋站点之间针对每种抗生素的耐药分离株比例。抗生素类别缩写为AMC 阿莫西林/克拉维酸AMP 氨苄青霉素AZM 阿奇霉素C 氯霉素CIP 环丙沙星CN 庆大霉素CRO 头孢曲松FOX 头孢西丁MEM 美罗培南S 链霉素SXT 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑TE 四环素。B 堆叠条形图上与 “Upset” 图下显示不同抗生素耐药组合的分离株数量与站点类别。星号表示符合 MDR 标准的 AMR 组合。在非污水位点回收的分离株中仅观察到 3 株满足 MDR 定义即对三类及以上不同类别抗生素耐药。相比之下污水排放口附近的海洋站点分离株中有 26/68 株38.2%为 MDR污水样本中 35/84 株41.7%为 MDR。64 株 MDR 分离株共呈现出 50 种独特的耐药谱。除氨苄青霉素与四环素耐药见于大多数 MDR 分离株外大量独特的 MDR 组合暗示了无法仅用少数独立耐药谱系传播来解释的遗传多样性。部分污水与排放口分离株对六类及以上抗生素呈现表型耐药。此外作者观察到 3 株携带对美罗培南meropenem表型耐药的独特菌株——鉴于世界卫生组织WHO已将碳青霉烯类耐药肠杆菌包括大肠杆菌列为重点优先级细菌病原体这一发现尤为值得关注。结果5抗微生物耐药大肠杆菌的系统基因组分析为探索岛周污水、排放口及在较小程度上海水中 MDR 的基因组基础作者选取了 183 株乳糖发酵肠杆菌科分离株中具有 AMR 表型的 53 株进行长读长测序主要关注 MDR 分离株。经过滤低质量组装后45 个高质量组装均产生了完整的无间隙细菌基因组其中 37 个至少包含一个完整质粒。基于 Clermont 分型与多位点序列分型multi-locus sequence typing, MLST的分析鉴定出 5 个不同的系统发育组A 组21 株人畜共生、B1 组15 株环境与动物相关、B2 组1 株高毒力人源相关、D 组5 株更强毒力的肠外病原体、E 组2 株与 D 组相关与食源性暴发相关以及 G 组1 株。值得注意的是分析发现了若干全球分布的、与 MDR 相关的高风险大流行克隆包括 ST10、ST58、ST69 和 ST155。Figure 5 图注45 株大肠杆菌分离株的染色体与质粒图谱。左侧为基于单拷贝基因构建的系统发育树Clermont 分型与 ST 序列型标注于旁。中间为组装的染色体与质粒图谱按大小降序排列。右侧热图显示各分离株的 AMR 基因检测结果深色热图。顶部星号表示主要在基因组中观察到的 AMR 基因。顶部带圈叉号表示带有定点突变的 AMR 基因。左侧红色标识符表示 D 组 MDR 大肠杆菌克隆详见图 6。染色体上几乎普遍存在多重耐药外排基因与喹诺酮耐药基因如 acr(E/F/S)、mdt(E/F/H/M/N/O/P)、emr(E/R)、evg(A/S)而氨基糖苷类、四环素类、磺胺类或大环内酯类的 AMR 基因几乎完全定位于质粒。这一发现凸显了长读长测序与质粒从头组装在 AMR 基因发现中的重要性。一组系统发育相关的 D 组 MDR 分离株PCP07014、SW070912、SW070910、SW071620 和 PCP06238尤其引人担忧——其中三株经 MLST 分析归属于 ST69 复合群这是与肠外感染包括尿路感染相关的全球大流行大肠杆菌谱系。所有 D 组分离株均来自污水或在 Punta Carola 排放口附近的海洋环境中分离获得且均在相同的三周时间内分离从而直接将污水污染与海洋环境中 MDR 的涌现联系起来。结果6D 组大肠杆菌的菌株水平分析鉴于 D 组分离株的致病潜力与巨大 AMR 负担作者针对 SW070912、SW070910、SW071620、PCP07014 和 PCP06238 开展了泛基因组分析。五株菌的泛基因组由 3483 个核心基因簇与 1354 个附属基因簇组成任意两株菌的核心基因组 SNP 差异不超过 300 个。从同一市政污水系统中相隔一周分离的两株 MDR 菌株 SW070910 与 SW071620 享有近乎相同的核心与附属基因组前者仅相差 150 个 SNP全基因组比对显示二者共线性良好除 SW070910 中一段 469 Kb 区域相对 SW071620 发生倒位外。Figure 6 图注A 五株 D 组 MDR 大肠杆菌的泛基因组分析核心基因簇与附属基因簇分别展示。B SW070910 与 SW071620 的质粒图谱质粒按大小降序标注P1最大。C SW071620 的 P4 与 SW070910 的 P2 等质粒的同线性比较可见 SW071620 的 P1 与 SW070910 超过 200 Kb 的接合 mega-质粒 P1 完全同线SW071620 的 P3 与 SW070910 P1 部分同线提示质粒正在发生融合或裂变。D SW070910 的 P1 质粒与 SW071620 的 P1、P3 质粒的相关性热图热图颜色强度反映 Jaccard 相似指数注释显示 AMR 基因定位于质粒中保守性有限或较差的区域。两株菌的质粒内容比较揭示了显著的质粒洗牌现象SW070910 与 SW071620 分别产生 4 个和 5 个全长质粒。接合性质粒 SW071620 的 P4 与 SW070910 的 P2 长度相近且高度同线可 mobilizable 质粒 SW071620 的 P1 在其 107 Kb 全长上与 SW070910 超过 200 Kb 的接合 mega-质粒 P1 完全同线SW071620 的接合性质粒 P3 则与 SW070910 P1 在约 50 Kb 长度上同线。这些结果表明这些质粒在不同细菌菌株中可能正在经历融合与/或裂变从而导致株内质粒异质性。为进一步评估质粒洗牌对 AMR 基因多样性的贡献作者将 mega-质粒与两个较小的同线性质粒与涵盖 40,757 个全球分布质粒的数据库进行 BLAST 比对并构建相关性矩阵热图。分析显示除少数小区室外SW071620 P3 质粒四分之三的连续区域在数据库中可被观察到代表了无 AMR 基因的稳定的质粒骨架SW071620 P1 包含一段约 20 Kb 的保守插入AMR 基因定位于保守性极小的区域提示这些基因为近期获得而在 mega-质粒中AMR 基因落于既不与质粒通用骨架也不与其他携带 AMR 基因区域相关联的区段。这表明导致 MDR 的 AMR 基因组合是在质粒中新近形成的并未与完全保守的基因盒或稳定质粒骨架谱系相耦合。由于携带这些质粒的细菌从可通达海洋环境的市政污水中分离获得这些质粒有可能导致对抗生素治疗无效的致病性大肠杆菌感染从而对动物或人类健康造成显著的发病与死亡风险。方法学参考本研究的方法学体系可概括为以下现场多模态工作流相关标准操作流程SOP已在 https://protocols.hostmicrobe.org/field-amr-sops 公开。现场水样采集无菌Whirl-Pak袋/有机棉塞现场过滤与DNA提取0.2μm硝酸纤维素膜Biomeme免离心试剂盒便携qPCR检测人源粪便Franklin thermocycler Biomeme Go AppMC-Media Pad培养活菌37°C 18-24h计数CFUMacConkey II平板传代筛选乳糖发酵肠杆菌科Kirby-Bauer纸片扩散法12种抗生素耐药表型纳米孔宏基因组测序MinION LSK110大肠杆菌分离株长读长全基因组测序MinION NBD114.24Flye组装 racon/medaka抛光AMRFinderPlus预测耐药基因Autocycler多汇编器共识组装Clermont分型 MLST AMR注释质粒同线性与全球质粒库BLAST比对Jaccard相似性分析可供同行借鉴的关键技术要点包括免冷链 DNA 提取使用 Biomeme M1 预填充试剂 cartridge 与注射器式提取柱无需移液器与离心机冻干 qPCR 反应Biomeme BioPoo Enterococcus Panel Go-Strips 三重探针 qPCR智能手机控制便携热循环仪干式培养系统MC-Media Pad 替代传统琼脂平板无需培养基制备长读长宏基因组纳米孔 MinION 配合 Flye 元组装、proovframe 移码校正、AMRFinderPlus 耐药基因预测菌株级质粒解析Autocycler 整合 flye/miniasm/raven 多汇编器输出实现无间隙基因组与完整质粒组装全球质粒库比对将组装质粒与 40,757 个全球质粒数据库进行 BLAST以 Jaccard 相似指数可视化质粒骨架保守性与 AMR 基因插入 novelty总结本研究针对圣克里斯托瓦尔岛污水处理厂长期超负荷运行、频繁将未处理污水排入 Puerto Baquerizo Moreno 周边海域的现实问题开发了一套多模态移动微生物学实验室。通过现场 qPCR 定位人类粪便污染热点结合长读长宏基因组测序与分离株表型/基因型分析研究取得以下核心结论第一污水排放口附近的海洋微生物群落发生根本性转变其分类学轮廓与市政未处理污水高度相似且 AMR 基因密度显著高于非污染海洋站点跨 9 个抗菌药物大类共检测到 94 个耐药基因。第二在污水与排放口附近的乳糖发酵肠杆菌科分离株中MDR 比例超过 40%污水 41.7%排放口附近海洋 38.2%远高于非污染位点仅 3 株 MDR。64 株 MDR 分离株呈现出 50 种独特耐药谱并检出 3 株对最后防线抗生素美罗培南耐药的分离株。第三系统基因组分析揭示MDR 表型的多样性主要由质粒而非染色体驱动——氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、大环内酯类等 AMR 基因几乎完全定位于质粒。对 D 组 MDR 大肠杆菌的深入分析表明AMR 基因在质粒骨架上频繁发生重排与重组形成并非由完全保守基因盒或稳定质粒谱系承载的新型 MDR 组合。这种基于质粒的快速洗牌机制解释了加拉帕戈斯岛 MDR 表型的高度动态性与新颖性。第四研究发现的 ST10、ST58、ST69、ST155 等均是全球分布的高风险大流行克隆其中 ST69 复合群与肠外感染密切相关。所有 D 组 MDR 分离株均在相同三周时间内从污水或 Punta Carola 排放口附近海洋环境中分离获得直接将污水污染与海洋 MDR 涌现联系起来。本研究不仅为资源有限环境下的 AMR 监测提供了可复制的范式——便携式智能手机驱动 qPCR、即用型冻干 qPCR 反应、MC-Media Pad 细菌分离等技术消除了耗时且易出错的操作步骤降低了对熟练技术人员的依赖为当地利益相关方参与监测工作打开了大门同时也强调了将 AMR 视为 One Health 挑战的重要性。圣克里斯托瓦尔岛周边海域栖息着群岛中浓度最高的加拉帕戈斯海狮Zalophus wollebaeki种群人类与海狮的密切互动为 MDR 大肠杆菌在海洋哺乳动物中的定植与扩散提供了途径可能对这一濒危物种的健康构成威胁。研究指出遏制 AMR 跨生态系统传播对 One Health 至关重要但这需要深入理解复杂微生物环境中 MDR 菌株与质粒涌现的机制。作者亦坦承移动 AMR 实验室的局限性便携 qPCR 与纳米孔测序仪器相对昂贵、培养工作仍依赖传统琼脂平板、生物信息学分析未能在现场完成等。未来可通过 Redigel 系统、Sensititre MIC 系统、便携式 GPU 加速现场分析、纳米孔碱基修饰检测与适应性测序等手段进一步优化。最终这项研究为加拉帕戈斯群岛的 AMR 风险评估与污水基础设施现代化升级提供了直接的科学支撑证明了移动微生物学实验室作为全球 AMR 监测模型在指导政策、公共工程与临床决策方面的强大潜力。参考文献Lal, A., Riopelle, J. C., Villarin, K., et al. (2026). Human wastewater contamination drives the emergence of multidrug-resistant bacteria in the Galápagos marine ecosystem.Nature Communications, 17, 7601. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74899-9现场 AMR 实验室标准操作流程https://protocols.hostmicrobe.org/field-amr-sops数据分析代码仓库https://github.com/ruicatxiao/GERA宏基因组测序数据Sequence Read Archive 登录号 PRJNA1320681大肠杆菌分离株全基因组测序数据Sequence Read Archive 登录号 PRJNA1320685加拉帕戈斯国家公园 2024 年关于圣克里斯托瓦尔岛海滩污染的制裁程序公告https://galapagos.gob.ec/comunicado-oficial-2/