本文内容速览你是否曾遭遇这样的困境通过酵母单杂Y1H筛库或DNA拉下实验联合质谱DNA Pull-down MS筛选上游转录因子结果却始终不理想不仅筛不到感兴趣的转录因子筛到的转录因子数量也少得可怜有时甚至一个转录因子都没有。实验操作明明严格按步骤执行结果却总不尽如人意这难免让人困惑和沮丧。大家不必苦恼其实筛不到转录因子并非罕见。今天伯小远将系统梳理可能导致筛选结果不理想的因素并提供一些切实可行的替代策略帮助大家跳出“筛不到”的怪圈为什么筛不到转录因子01时空特异性表达在植物的基因组中编码转录因子的基因数量通常占所有基因的5%到7%不同物种的具体数量有所差异通常可达到2000个左右(Gray et al., 2025)。但这并不意味着这些转录因子具有较高的表达和蛋白丰度。许多植物转录因子的表达具有明显的细胞、组织、发育阶段或环境条件特异性可随特定生理或环境信号而发生变化(Rossel et al., 2007; Voß et al., 2015; Han et al., 2023; Liew et al., 2024)。2023年10月北京大学现代农业研究院邓兴旺课题组联合何航课题组在NaturePlants杂志上发表了一篇题为“Time series single-cell transcriptional atlases reveal cell fate differentiation driven by light inArabidopsisseedlings”的研究论文。该文章利用时间序列单细胞RNA测序绘制了拟南芥幼苗在“黑暗–去黄化–光照”过程中约92861个细胞的转录组动态图谱。作者对7种主要细胞类型在5个时间点的基因表达进行加权基因共表达网络分析共划分出73个表达模块。其中韧皮部发育关键转录因子APL在光照过程中表现出明显的诱导表达其表达动态与DOF5.6、MYR1、EFM等转录因子相似并被归入与韧皮部发育相关的共表达模块。同时作者发现在光照和黑暗条件下气孔发育呈现出截然不同的发育轨迹相关转录因子呈现出明显的环境条件和发育阶段特异性表达图1。其中bHLH167在黑暗条件下特异性地表达于保卫细胞光照后表达减弱而FAMA的表达具有光依赖性仅在光照条件下的保卫母细胞和保卫细胞中表达在黑暗条件下无表达。图1 气孔发育的调控模型。黑色圆点表示相应的细胞簇0–9。属于不同细胞簇的细胞分别用不同颜色表示(Han et al., 2023)。鉴于转录因子表达具有时空特异性如果Y1H建库或DNA Pull-down MS所使用的组织材料与目标基因表达的时空背景不匹配感兴趣的转录因子可能在酵母cDNA文库或蛋白提取物中缺失或丰度较低进而降低其被筛选到或质谱检测到的可能性。02结合依赖性转录因子对靶基因的识别及其调控功能并非仅由自身的DNA结合特性决定还受到染色质状态、蛋白质互作、共调节因子、翻译后修饰等多种因素的影响(Isbel et al., 2022; Kim et al., 2022; Strader et al., 2022; Gao et al., 2022)。对于部分转录因子而言其DNA结合能力或有效的转录调控依赖于二聚体、多聚体或其他蛋白质复合体的形成(Kim et al., 2022; Van et al., 2023)。2022年12月美国得克萨斯大学Keiko U. Torii课题组在NaturePlants杂志上发表了一篇题为“Dynamic chromatin accessibility deploys heterotypic cis/trans-acting factors driving stomatal cell-fate commitment”的研究论文。该文章系统揭示了拟南芥植物气孔发育过程中从增殖到分化的转换细胞命运决定如何由染色质可及性与转录因子协同调控。bHLH转录因子SPCH和MUTE通过分别与SCRM形成异源二聚体驱动气孔细胞的起始/增殖和细胞命运决定。SPCH-SCRM和MUTE-SCRM异源二聚体复合物在体外和体内都偏好结合E-boxCANNTG基序。然而作者通过染色质可及性测序ATAC-seq发现虽然它们都大量结合于ELC早期谱系开放染色质区的E-box基序motif但在PCC后期分化染色质区的E-box motif上结合极少图2a、b。这说明如果靶位点处于关闭的染色质状态转录因子也无法有效结合并发挥功能。染色质免疫共沉淀测序ChIP-seq显示SPCH-SCRM和MUTE-SCRM异源二聚体复合物的结合峰中富集BBR/BPCGAGAmotif图2c、d但Y1H和BLI证明SPCH-SCRM/MUTE-SCRM本身不直接结合GAGA motif其中MUTE-SCRM可通过与共调节因子BPC1/2形成复合物由BPC1/2作为“桥梁”锚定到GAGA motif上而SPCH-SCRM因不与BPC1/2互作无法实现这一锚定。这揭示了转录因子可通过共调节因子间接识别非自身顺式元件极大拓展了调控网络的复杂性。图2 SPCH-SCRM和MUTE-SCRM异源二聚体复合物的ATAC-seq和ChIP-seq结果(Kim et al., 2022)。a、b柱状图展示了在ELC或PCC超敏感位点THS上被SPCH-SCRMa或MUTE- SCRMb结合或未结合的动态THS的总数c、d使用HOMER对SPCH-SCRM ChIP-seqc或MUTE- SCRM ChIP-seqd的结合峰进行motif从头富集分析显示排名前3的motif结果及对应的P值。2023年2月德国柏林洪堡大学Kerstin Kaufman课题组联合荷兰瓦赫宁根Gerco C. Angenent课题组在NaturePlants杂志上发表了一篇题为“Dual specificity and target gene selection by the MADS-domain protein FRUITFULL”的研究论文。该文章系统揭示了植物MADS-box转录因子FRUITFULLFUL在不同组织花序分生组织和雌蕊中通过改变二聚体的组成来调控不同靶基因的分子机制。作者发现FUL既在花序分生组织IM中促进开花转变又在雌蕊/果实中抑制裂荚区域的形成。通过研究发现FUL这种组织特异性功能并非仅由染色质状态决定而主要源于其与不同MADS蛋白如SEP1/3、AG、SOC1形成异源二聚体这些二聚体具有不同的DNA结合偏好性图3从而在花序分生组织和雌蕊中识别不同的CArG-box变体序列实现靶基因的差异化选择。图3 FUL二聚体的DNA结合特异性热图及对应的基序标识motif logos(Van et al., 2023)。经典Y1H筛库通常以单个AD融合蛋白作为猎物因此对于必须依赖其他蛋白伙伴才能形成有效DNA结合的转录因子其结合能力可能无法在酵母体系中重现从而产生假阴性(Gubelmann et al., 2013; Bass et al., 2016)。同时诱饵DNA片段会结合到酵母染色质中但酵母的染色质结构与其核小体定位规律与植物转录因子的天然染色质环境存在巨大差异(Shrestha et al., 2019)。DNA Pull-down MSDNA Pull-down MS实验通常涉及组织提取、细胞裂解和多次洗涤步骤可能削弱低亲和力或动态的蛋白-蛋白相互作用导致异源二聚体或多亚基复合物部分解离进而降低转录因子或复合物组分被捕获和质谱鉴定的概率。DNA Pull-down使用的是裸露的DNA探针完全脱离了核小体、组蛋白修饰及三维染色质结构的调控。许多转录因子特别是先锋因子的有效结合依赖于染色质的开放状态或特定修饰(Zaret et al., 2020)而这些在体外裸露DNA上无法重现。03动态瞬时互作转录因子与DNA的结合并不是持续、稳定地保持而往往是一个不断结合和解离的动态过程(Morisaki et al., 2014; Zhang et al., 2022)部分转录因子只在很短的时间内与DNA结合完成调控后便迅速离开(Swift et al., 2017; Alvarez et al., 2020)。美国纽约大学Gloria M. Coruzzi课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“Transient genome-wide interactions of the master transcription factor NLP7 initiate a rapid nitrogenresponse cascade”的研究论文。该文章通过结合染色质免疫共沉淀测序ChIP-seq和DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定DamID-seq技术系统揭示了植物氮信号主调控因子NLP7在根细胞中与基因组靶标的瞬时结合如何启动快速氮响应转录级联反应图4。作者在地塞米松诱导NLP7入核后的5、10、30、180分钟分别进行了ChIP-seq。结果发现NLP7入核后全基因组结合位点在5分钟达峰值随后在10、30、180分钟急剧减少说明NLP7与大多数靶标的结合是短暂的不会长期停留在DNA上。NLP7有492个直接调控基因但在所有时间点都检测不到NLP7与其中270个调控基因的结合暗示结合时间极短短到常规方法无法捕捉。DamID技术通过永久甲基化标记记录转录因子的触碰痕迹成功捕捉到ChIP-seq漏掉的92个上述靶标证明NLP7曾结合过但随后解离了。作者利用4tU标记了NLP7入核和入核后3小时180分钟内新合成的mRNA。结果显示在NLP7已解离的3小时后这些靶标基因仍在活跃合成新RNA直接验证了“Hit-and-Run”打了就跑机制——转录因子短暂结合启动转录后便离开转录过程自行延续。图4 NLP7通过“Hit-and-Run”机制快速启动级联反应进而放大下游氮响应的模型(Alvarez et al., 2020)。对于这类动态、快速解离的转录因子-DNA互作在Y1H筛库中可能因结合不足以产生稳定、可检测的报告基因激活信号而导致假阴性而在DNA Pull-down MS中则可能因蛋白在孵育或后续洗涤过程中从DNA探针上解离导致目标转录因子富集不足最终降低质谱鉴定的可能性。04启动子片段过长酵母单杂筛库中诱饵DNA序列整合到酵母基因组后会形成染色质结构较长DNA区域中部分转录因子的结合位点可能受到酵母核小体遮挡同时远离报告基因最小启动子的DNA-转录因子互作可能难以产生足够强的报告信号(Shrestha et al., 2019; Fañanás‐Pueyo et al., 2024)。对于DNA Pull-down MS而言启动子过长并不意味着一定无法筛到转录因子。过长的DNA片段可能增加非特异性DNA结合蛋白的捕获并且同时包含多个不同的顺式作用元件会使获得的蛋白谱更加复杂从而降低转录因子的相对富集程度(Serebreni et al., 2023)。尤其当目标转录因子本身表达量较低或与DNA结合较弱时这种背景稀释效应可能进一步增加其被MS检测到的难度。因此对于较长启动子采用截短或分段策略通常更有利于定位功能性转录因子的结合区域(Shrestha et al., 2019; Zhang et al., 2023; Fañanás‐Pueyo et al., 2024)。小结综合这些原因Y1H筛库或DNA Pull-down MS可能筛不到转录因子但不一定意味着没有转录因子参与目标基因的调控可能与样品中转录因子缺失或丰度低、结合依赖特定条件、互作瞬时动态或实验设计等因素有关。因此阴性结果需要结合具体实验体系和转录因子的生物学特性进行综合判断。筛不到转录因子怎么办如果筛选结果不理想与其反复重复相同的筛选流程不如先分析具体的失败原因再针对性调整筛选策略。根据前面提到的问题可以从构建专用型转录因子文库、预测候选转录因子并多层次验证以及对启动子分段定位关键顺式元件等方面提高筛选效率。01构建专用型转录因子文库2024年1月中国农业科学院柑桔研究所李强课题组在Journal of Integrative Agriculture杂志上发表了一篇题为“High-throughput screening system of citrus bacterial cankerassociated transcription factors and its application to the regulation of citrus canker resistance”的研究论文。该文章构建了CBC诱导转录因子的高通量酵母文库并利用其成功筛选出CsDOF5.8作为CsPrx25的上游转录激活因子。为高效解析柑橘溃疡病CBC的抗性调控网络作者首先对感病品种“万锦橙”和抗病品种“金桔”在柑橘黄单胞菌Xcc感染后多个时间点进行转录组测序鉴定出253个差异表达的CBC诱导型转录因子DETFs并成功克隆了其中203个转录因子的全长CDS。在文库构建上作者采用同源重组法将每20个TF的PCR产物批量连接至线性化的AD载体中再转化大肠杆菌最终构建的酵母文库容量高达1×107CFU且阳性率和覆盖率均达到100%图5。图5 CBC诱导型AD-TF文库的构建与评估(Fu et al., 2024)。A文库构建流程示意图B文库阳性率检测随机挑选的30个文库单克隆1-30的PCR扩增胶图C文库覆盖率测定随机挑选的30个DETF基因单克隆TF#的PCR扩增胶图。M分子量标记Marker。接着作者利用该专用型文库筛选抗病基因CsPrx25的上游转录因子成功钓取到CsDOF5.8。并通过凝胶迁移实验EMSA、双荧光素酶报告基因Dual-LUC图6和瞬时过表达等实验证实CsDOF5.8能直接结合CsPrx25的启动子并激活其表达从而上调过氧化物酶PRX25的活性和增加H₂O₂含量来增强柑橘对溃疡病的抗性。这些结果充分证明了该高通量转录因子文库在快速、精准构建CBC抗病调控通路中的高效实用价值。图6 CsDOF5.8直接结合CsPrx25的启动子并激活其表达(Fu et al., 2024)。A用于EMSA实验的野生型WT和突变型探针。突变结合位点以红色显示BEMSA实验结果显示CsDOF5.8特异性结合CsPrx25的启动子结合位点C用于双荧光素酶Dual-LUC实验的报告载体和效应载体DDual-LUC实验结果显示CsDOF5.8直接结合CsPrx25的启动子并激活其表达。在A、C和D中Pro25CsPrx25的1kb启动子Pro25MA中所示突变了预测结合位点的CsPrx251-kb启动子。02预测验证2024年5月扬州大学农学院刘巧泉和李钱峰课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“ABA-mediated regulation of rice grain quality and seed dormancy via the NF-YB1- SLRL2-bHLH144 Module”的研究论文。该文章揭示了植物激素脱落酸ABA通过“NF-YB1-SLRL2-bHLH144”全新分子模块协同调控水稻品质与种子休眠的机制。作者在寻找介导ABA调控Wx基因的转录因子时采用了一套“生物信息学初筛-表达谱复筛-时空表达定位”的严谨逻辑层层递进最终锁定了转录因子SLRL2。在进行数据库搜索之前作者先基于前期实验明确了两个必须满足的筛选条件即该转录因子的表达必须对ABA敏感并且与目标基因Wx在时空表达上高度协同。基于上述双重标准作者通过分析Rice FREND、RiceXPro和PlantTFDB三个数据库中所有转录因子在ABA处理下的表达变化以及与Wx基因的共表达系数初步筛选出了SLRL2和NF-YC9两个候选基因。接着为了验证数据库预测结果作者通过实时荧光定量PCRRT-qPCR检验发现SLRL2的表达确实被ABA强烈诱导且被ABA合成抑制剂显著抑制。而NF-YC9对ABA的响应非常微弱图7a-c。所以作者排除了NF-YC9将候选范围缩小至SLRL2。一个转录因子要调控种子中的Wx必须在种子发育期且在合成淀粉的组织中表达因此作者进一步分析了SLRL2的时空表达模式与组织定位。结果显示SLRL2与Wx在水稻发育的种子中具有完全一致的表达趋势图7d-fSLRL2的mRNA信号特异性分布在糊粉层和淀粉胚乳中图7g、h这正是Wx发挥作用合成直链淀粉的部位此外与SLRL2共表达的所有基因显著富集在“淀粉和蔗糖代谢”通路中图7i。作者锁定SLRL2为候选转录因子后通过DNA-蛋白互作等实验验证了SLRL2能直接结合Wx启动子上的CTCC motif直接抑制Wx表达。图7 检测SLRL2和NF-YC9对ABA响应情况以及时空表达模式与组织定位(Wang et al., 2024)。aSLRL2和NF-YC9在ABA或ABA合成抑制剂Fluridone处理下的表达情况bSLRL2和NF-YC9在短时间ABA处理下的表达情况。分别在50μM ABA处理前、处理后30分钟和60分钟采集水稻样品。在a、b中以OsUBCI作为内参基因归一化基因表达。未处理ABA或野生型对照样品中目标基因的表达水平设为1c采用双荧光素酶报告实验检测SLRL2对不同浓度ABA处理的响应d-fWxd、SLRL2e和NF-YC9f在水稻不同组织中的时空表达模式。以OsActin01为内参标准化基因表达。将基因在开花后5天5DAF的种子中的表达水平设为1。幼根YR和幼芽YS样品来自14日龄的水稻幼苗。茎、叶片、叶鞘和幼穗YP样品均来自孕穗期水稻。发育种子样品在0、5、10、15、20、25和30DAF收集g在5DAF的水稻种子中SLRL2的原位杂交分析。SE淀粉胚乳AL糊粉层PE果皮hSLRL2原位杂交的阴性对照iKEGG富集分析。2026年5月上海交通大学张才喜课题组联合云南农业大学段胜常课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“Pangenome and resequencing analyses reveal flowering evolution and genetic control inCerasus”的研究论文。该文章构建了首个覆盖17个物种、21个种质的樱属泛基因组揭示了PavAGL9受PavBPC6负调控并促进开花为樱桃开花期改良提供了关键基因资源。作者采用了“生物信息学预测表达模式相关性”的策略来寻找并验证PavAGL9的上游转录因子。首先利用植物转录因子预测数据库PlantRegMap以PavAGL9的启动子序列为诱饵作者预测出74个可能结合其启动子的候选转录因子。同时基于RNA-seq数据构建了加权基因共表达网络WGCNA图8。通过计算基因间的表达相关性发现74个候选转录因子中PavBPC6与PavAGL9的表达模式呈现出最强的相关性。因此PavBPC6被选定为最核心的上游候选调控因子。图8 WGCNA热图展示出高度相关的模块相关系数≥0.9与三个物种的花发育相关(Jiu et al., 2026)。灰色方块中包含该模块的基因数量紫色以及注释为花发育相关基因的子集数量蓝色。然后作者通过Y1H、EMSA、Dual-LUC证实了PavBPC6直接结合PavAGL9的启动子并抑制其转录活性图9a-e。作者在满足需冷量的甜樱桃花蕾中瞬时过表达PavBPC6。结果表明花蕾开花延迟且伴随PavAGL9表达量显著下调直接证明了该调控关系在樱桃原生组织中的生物学功能。图9 PavBPC6结合PavAGL9启动子抑制其转录并参与樱桃开花期的调控(Jiu et al., 2026)。aY1H实验证实PavBPC6与PavAGL9启动子结合bEMSA表明PavBPC6与含有motif的PavAGL9启动子片段相互作用cDual-LUC载体的示意图dDual-LUC实验显示PavBPC6抑制PavAGL9的转录e以LUC与REN的比值表示启动子活性。03启动子分段定位关键元件2023年6月中国农业科学院曹双河课题组联合西北农林科技大学宋喜悦课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Efficient proteome-wide identification of transcription factors targeting Glu-1: A case study for functional validation of TaB3-2A1 in wheat”的研究论文。该文章通过DNA Pull-down MS鉴定到了靶向小麦Glu-1启动子的转录因子TaB3-2A1并证实TaB3-2A1通过抑制储藏蛋白合成、促进淀粉积累及影响农艺性状。作者没有使用完整的启动子而是使用CCRM1-1位于起始密码子上游-208bp至-101bp进行了DNA Pull-down MS实验。CCRM1-1是作者团队在2019年发表的一项前期研究中通过系统分析并实验验证出的最关键的顺式调控模块。在前期的工作中作者首先通过生物信息学分析在Glu-1基因起始密码子上游1kb-1000bp至-1bp的启动子区域内识别出了30个保守的DNA motif图10。根据这些motif在启动子上的分布模式作者将这些区域划分为三个主要的保守顺式调控模块图10。图10Glu-1启动子中保守的顺式调控模块CCRMs。motif位置以起始密码子为参考点标示(Li et al., 2019)。在CCRM1中TOA、E-box和A-box分别与I-box、CCAAT和SEF4重叠。CCRM1可进一步分为两个亚模块CCRM1-1和CCRM1-2。为验证这些模块的功能作者构建了Glu-1启动子片段与GUS报告基因融合的pGUS300含CCRM1核心区、pGUS650含CCRM1CCRM2核心区和pGUS950含CCRM1CCRM2CCRM3核心区三个载体通过检测转基因小麦中GUS基因的表达情况来评估不同启动子片段的活性。实验结果表明CCRM2和CCRM3不影响表达特异性仅增强表达水平CCRM1核心区-300bp至-1bp已足以确保Glu-1基因在种子发育中精确的起始和时空表达模式图11。图11 携带pGUS300、pGUS650或pGUS950载体的转基因种子中的GUS染色情况和GUS相对表达量(Li et al., 2019)。a转基因种子发育过程中的GUS染色情况。自开花后5天5DAF起每5天收集一次种子b30DAF时种子中的GUS活性c发育种子中GUS报告基因的转录模式。转录水平以延伸因子1αeF1α为内参基因进行归一化。将CCRM1进一步细分构建pGUS208删除CCRM1-2保留CCRM1-1核心区和pGUS100仅包含核心区两个载体结果发现CCRM1-1-208bp至-101bp区域对于Glu-1基因的表达水平和表达特异性都至关重要图12。而CCRM1的另一部分CCRM1-2-300bp至-209bp则主要影响表达水平对特异性无影响图12。综上作者才从长达1kb的启动子序列中逐步缩小范围并最终确定了CCRM1-1这个仅108bp的关键调控区域。图12 携带pGUS100、pGUS208或pGUS300载体的转基因种子中的GUS染色情况和GUS相对表达量以及转基因小麦不同组织的GUS染色情况(Li et al., 2019)。a转基因种子的组织化学染色分析。自开花后5天5DAF起每5天收集一次种子b30DAF成熟种子中的GUS活性c发育期种子内的GUS基因表达量。相对表达量以延伸因子1αeF1α为内参基因进行归一化d携带pGUS100和pGUS208载体的转基因小麦不同组织的GUS染色。植物组织于开花两周后采集。作者以CCRM1-1为探针进行DNA Pull-down MS实验。通过比对小麦蛋白数据库从海量数据中筛选出被富集的蛋白质。再根据UniProt等数据库的注释从中剔除大量非特异性结合的代谢酶和激酶最终提取出31个转录因子涵盖B3、MYB、NAC等转录因子家族图13b。图13 鉴定结合于Glu-1启动子中CCRM1-1的转录因子(Xie et al., 2023)。a凝胶电泳及银染显示DNA pull-down实验中以CCRM1-1为探针所捕获的蛋白质。M蛋白质分子量Marker1带有CCRM1-1探针标记的磁珠捕获的蛋白质2未标记磁珠捕获的蛋白质b扇形图显示通过质谱鉴定到的与CCRM1-1结合的蛋白质组分。c使用PLACE数据库预测鉴定到的转录因子与CCRM1-1结合的motif。*表示具有与经典序列相似的motif。B3转录因子家族成员在种子发育中功能多样但具体调控Glu-1的机制尚不清晰作者发现B3转录因子家族中TaB3-2A1的表达量最高因此选择它作为该家族的代表性基因进行后续功能研究。Y1H、EMSA实验验证了TaB3-2A1与CCRM1-1的直接结合图14a、d。Dual-LUC实验证实TaB3-2A1能显著抑制由Glu-1启动子驱动的LUC报告基因活性确定其为转录抑制因子图14b、c。图14 TaB3‑2A1与CCRM1‑1结合的验证(Xie et al., 2023)。aY1H实验验证TaB3‑2A1与CCRM1‑1的结合b、cDual-LUC实验证实TaB3-2A1能显著抑制由Glu-1启动子驱动的LUC报告基因活性dEMSA验证TaB3‑2A1与CCRM1‑1在体外互作。小远叨叨总的来说Y1H筛库或DNA Pull-down MS筛不到转录因子往往是多种因素共同作用的结果。本文主要介绍了部分常见原因及相应的解决思路但实际实验中还有许多影响筛选结果的因素和应对策略。由于篇幅有限伯小远将在后续内容中继续为大家介绍。面对筛选结果不理想时与其反复重复相同的实验不如结合具体实验体系和研究目的灵活调整策略。不要让“筛不到”成为研究的终点ReferencesAlvarez J M, Schinke A L, Brooks M D, et al. 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本文内容速览你是否曾遭遇这样的困境通过酵母单杂Y1H筛库或DNA拉下实验联合质谱DNA Pull-down MS筛选上游转录因子结果却始终不理想不仅筛不到感兴趣的转录因子筛到的转录因子数量也少得可怜有时甚至一个转录因子都没有。实验操作明明严格按步骤执行结果却总不尽如人意这难免让人困惑和沮丧。大家不必苦恼其实筛不到转录因子并非罕见。今天伯小远将系统梳理可能导致筛选结果不理想的因素并提供一些切实可行的替代策略帮助大家跳出“筛不到”的怪圈为什么筛不到转录因子01时空特异性表达在植物的基因组中编码转录因子的基因数量通常占所有基因的5%到7%不同物种的具体数量有所差异通常可达到2000个左右(Gray et al., 2025)。但这并不意味着这些转录因子具有较高的表达和蛋白丰度。许多植物转录因子的表达具有明显的细胞、组织、发育阶段或环境条件特异性可随特定生理或环境信号而发生变化(Rossel et al., 2007; Voß et al., 2015; Han et al., 2023; Liew et al., 2024)。2023年10月北京大学现代农业研究院邓兴旺课题组联合何航课题组在NaturePlants杂志上发表了一篇题为“Time series single-cell transcriptional atlases reveal cell fate differentiation driven by light inArabidopsisseedlings”的研究论文。该文章利用时间序列单细胞RNA测序绘制了拟南芥幼苗在“黑暗–去黄化–光照”过程中约92861个细胞的转录组动态图谱。作者对7种主要细胞类型在5个时间点的基因表达进行加权基因共表达网络分析共划分出73个表达模块。其中韧皮部发育关键转录因子APL在光照过程中表现出明显的诱导表达其表达动态与DOF5.6、MYR1、EFM等转录因子相似并被归入与韧皮部发育相关的共表达模块。同时作者发现在光照和黑暗条件下气孔发育呈现出截然不同的发育轨迹相关转录因子呈现出明显的环境条件和发育阶段特异性表达图1。其中bHLH167在黑暗条件下特异性地表达于保卫细胞光照后表达减弱而FAMA的表达具有光依赖性仅在光照条件下的保卫母细胞和保卫细胞中表达在黑暗条件下无表达。图1 气孔发育的调控模型。黑色圆点表示相应的细胞簇0–9。属于不同细胞簇的细胞分别用不同颜色表示(Han et al., 2023)。鉴于转录因子表达具有时空特异性如果Y1H建库或DNA Pull-down MS所使用的组织材料与目标基因表达的时空背景不匹配感兴趣的转录因子可能在酵母cDNA文库或蛋白提取物中缺失或丰度较低进而降低其被筛选到或质谱检测到的可能性。02结合依赖性转录因子对靶基因的识别及其调控功能并非仅由自身的DNA结合特性决定还受到染色质状态、蛋白质互作、共调节因子、翻译后修饰等多种因素的影响(Isbel et al., 2022; Kim et al., 2022; Strader et al., 2022; Gao et al., 2022)。对于部分转录因子而言其DNA结合能力或有效的转录调控依赖于二聚体、多聚体或其他蛋白质复合体的形成(Kim et al., 2022; Van et al., 2023)。2022年12月美国得克萨斯大学Keiko U. Torii课题组在NaturePlants杂志上发表了一篇题为“Dynamic chromatin accessibility deploys heterotypic cis/trans-acting factors driving stomatal cell-fate commitment”的研究论文。该文章系统揭示了拟南芥植物气孔发育过程中从增殖到分化的转换细胞命运决定如何由染色质可及性与转录因子协同调控。bHLH转录因子SPCH和MUTE通过分别与SCRM形成异源二聚体驱动气孔细胞的起始/增殖和细胞命运决定。SPCH-SCRM和MUTE-SCRM异源二聚体复合物在体外和体内都偏好结合E-boxCANNTG基序。然而作者通过染色质可及性测序ATAC-seq发现虽然它们都大量结合于ELC早期谱系开放染色质区的E-box基序motif但在PCC后期分化染色质区的E-box motif上结合极少图2a、b。这说明如果靶位点处于关闭的染色质状态转录因子也无法有效结合并发挥功能。染色质免疫共沉淀测序ChIP-seq显示SPCH-SCRM和MUTE-SCRM异源二聚体复合物的结合峰中富集BBR/BPCGAGAmotif图2c、d但Y1H和BLI证明SPCH-SCRM/MUTE-SCRM本身不直接结合GAGA motif其中MUTE-SCRM可通过与共调节因子BPC1/2形成复合物由BPC1/2作为“桥梁”锚定到GAGA motif上而SPCH-SCRM因不与BPC1/2互作无法实现这一锚定。这揭示了转录因子可通过共调节因子间接识别非自身顺式元件极大拓展了调控网络的复杂性。图2 SPCH-SCRM和MUTE-SCRM异源二聚体复合物的ATAC-seq和ChIP-seq结果(Kim et al., 2022)。a、b柱状图展示了在ELC或PCC超敏感位点THS上被SPCH-SCRMa或MUTE- SCRMb结合或未结合的动态THS的总数c、d使用HOMER对SPCH-SCRM ChIP-seqc或MUTE- SCRM ChIP-seqd的结合峰进行motif从头富集分析显示排名前3的motif结果及对应的P值。2023年2月德国柏林洪堡大学Kerstin Kaufman课题组联合荷兰瓦赫宁根Gerco C. Angenent课题组在NaturePlants杂志上发表了一篇题为“Dual specificity and target gene selection by the MADS-domain protein FRUITFULL”的研究论文。该文章系统揭示了植物MADS-box转录因子FRUITFULLFUL在不同组织花序分生组织和雌蕊中通过改变二聚体的组成来调控不同靶基因的分子机制。作者发现FUL既在花序分生组织IM中促进开花转变又在雌蕊/果实中抑制裂荚区域的形成。通过研究发现FUL这种组织特异性功能并非仅由染色质状态决定而主要源于其与不同MADS蛋白如SEP1/3、AG、SOC1形成异源二聚体这些二聚体具有不同的DNA结合偏好性图3从而在花序分生组织和雌蕊中识别不同的CArG-box变体序列实现靶基因的差异化选择。图3 FUL二聚体的DNA结合特异性热图及对应的基序标识motif logos(Van et al., 2023)。经典Y1H筛库通常以单个AD融合蛋白作为猎物因此对于必须依赖其他蛋白伙伴才能形成有效DNA结合的转录因子其结合能力可能无法在酵母体系中重现从而产生假阴性(Gubelmann et al., 2013; Bass et al., 2016)。同时诱饵DNA片段会结合到酵母染色质中但酵母的染色质结构与其核小体定位规律与植物转录因子的天然染色质环境存在巨大差异(Shrestha et al., 2019)。DNA Pull-down MSDNA Pull-down MS实验通常涉及组织提取、细胞裂解和多次洗涤步骤可能削弱低亲和力或动态的蛋白-蛋白相互作用导致异源二聚体或多亚基复合物部分解离进而降低转录因子或复合物组分被捕获和质谱鉴定的概率。DNA Pull-down使用的是裸露的DNA探针完全脱离了核小体、组蛋白修饰及三维染色质结构的调控。许多转录因子特别是先锋因子的有效结合依赖于染色质的开放状态或特定修饰(Zaret et al., 2020)而这些在体外裸露DNA上无法重现。03动态瞬时互作转录因子与DNA的结合并不是持续、稳定地保持而往往是一个不断结合和解离的动态过程(Morisaki et al., 2014; Zhang et al., 2022)部分转录因子只在很短的时间内与DNA结合完成调控后便迅速离开(Swift et al., 2017; Alvarez et al., 2020)。美国纽约大学Gloria M. Coruzzi课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“Transient genome-wide interactions of the master transcription factor NLP7 initiate a rapid nitrogenresponse cascade”的研究论文。该文章通过结合染色质免疫共沉淀测序ChIP-seq和DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定DamID-seq技术系统揭示了植物氮信号主调控因子NLP7在根细胞中与基因组靶标的瞬时结合如何启动快速氮响应转录级联反应图4。作者在地塞米松诱导NLP7入核后的5、10、30、180分钟分别进行了ChIP-seq。结果发现NLP7入核后全基因组结合位点在5分钟达峰值随后在10、30、180分钟急剧减少说明NLP7与大多数靶标的结合是短暂的不会长期停留在DNA上。NLP7有492个直接调控基因但在所有时间点都检测不到NLP7与其中270个调控基因的结合暗示结合时间极短短到常规方法无法捕捉。DamID技术通过永久甲基化标记记录转录因子的触碰痕迹成功捕捉到ChIP-seq漏掉的92个上述靶标证明NLP7曾结合过但随后解离了。作者利用4tU标记了NLP7入核和入核后3小时180分钟内新合成的mRNA。结果显示在NLP7已解离的3小时后这些靶标基因仍在活跃合成新RNA直接验证了“Hit-and-Run”打了就跑机制——转录因子短暂结合启动转录后便离开转录过程自行延续。图4 NLP7通过“Hit-and-Run”机制快速启动级联反应进而放大下游氮响应的模型(Alvarez et al., 2020)。对于这类动态、快速解离的转录因子-DNA互作在Y1H筛库中可能因结合不足以产生稳定、可检测的报告基因激活信号而导致假阴性而在DNA Pull-down MS中则可能因蛋白在孵育或后续洗涤过程中从DNA探针上解离导致目标转录因子富集不足最终降低质谱鉴定的可能性。04启动子片段过长酵母单杂筛库中诱饵DNA序列整合到酵母基因组后会形成染色质结构较长DNA区域中部分转录因子的结合位点可能受到酵母核小体遮挡同时远离报告基因最小启动子的DNA-转录因子互作可能难以产生足够强的报告信号(Shrestha et al., 2019; Fañanás‐Pueyo et al., 2024)。对于DNA Pull-down MS而言启动子过长并不意味着一定无法筛到转录因子。过长的DNA片段可能增加非特异性DNA结合蛋白的捕获并且同时包含多个不同的顺式作用元件会使获得的蛋白谱更加复杂从而降低转录因子的相对富集程度(Serebreni et al., 2023)。尤其当目标转录因子本身表达量较低或与DNA结合较弱时这种背景稀释效应可能进一步增加其被MS检测到的难度。因此对于较长启动子采用截短或分段策略通常更有利于定位功能性转录因子的结合区域(Shrestha et al., 2019; Zhang et al., 2023; Fañanás‐Pueyo et al., 2024)。小结综合这些原因Y1H筛库或DNA Pull-down MS可能筛不到转录因子但不一定意味着没有转录因子参与目标基因的调控可能与样品中转录因子缺失或丰度低、结合依赖特定条件、互作瞬时动态或实验设计等因素有关。因此阴性结果需要结合具体实验体系和转录因子的生物学特性进行综合判断。筛不到转录因子怎么办如果筛选结果不理想与其反复重复相同的筛选流程不如先分析具体的失败原因再针对性调整筛选策略。根据前面提到的问题可以从构建专用型转录因子文库、预测候选转录因子并多层次验证以及对启动子分段定位关键顺式元件等方面提高筛选效率。01构建专用型转录因子文库2024年1月中国农业科学院柑桔研究所李强课题组在Journal of Integrative Agriculture杂志上发表了一篇题为“High-throughput screening system of citrus bacterial cankerassociated transcription factors and its application to the regulation of citrus canker resistance”的研究论文。该文章构建了CBC诱导转录因子的高通量酵母文库并利用其成功筛选出CsDOF5.8作为CsPrx25的上游转录激活因子。为高效解析柑橘溃疡病CBC的抗性调控网络作者首先对感病品种“万锦橙”和抗病品种“金桔”在柑橘黄单胞菌Xcc感染后多个时间点进行转录组测序鉴定出253个差异表达的CBC诱导型转录因子DETFs并成功克隆了其中203个转录因子的全长CDS。在文库构建上作者采用同源重组法将每20个TF的PCR产物批量连接至线性化的AD载体中再转化大肠杆菌最终构建的酵母文库容量高达1×107CFU且阳性率和覆盖率均达到100%图5。图5 CBC诱导型AD-TF文库的构建与评估(Fu et al., 2024)。A文库构建流程示意图B文库阳性率检测随机挑选的30个文库单克隆1-30的PCR扩增胶图C文库覆盖率测定随机挑选的30个DETF基因单克隆TF#的PCR扩增胶图。M分子量标记Marker。接着作者利用该专用型文库筛选抗病基因CsPrx25的上游转录因子成功钓取到CsDOF5.8。并通过凝胶迁移实验EMSA、双荧光素酶报告基因Dual-LUC图6和瞬时过表达等实验证实CsDOF5.8能直接结合CsPrx25的启动子并激活其表达从而上调过氧化物酶PRX25的活性和增加H₂O₂含量来增强柑橘对溃疡病的抗性。这些结果充分证明了该高通量转录因子文库在快速、精准构建CBC抗病调控通路中的高效实用价值。图6 CsDOF5.8直接结合CsPrx25的启动子并激活其表达(Fu et al., 2024)。A用于EMSA实验的野生型WT和突变型探针。突变结合位点以红色显示BEMSA实验结果显示CsDOF5.8特异性结合CsPrx25的启动子结合位点C用于双荧光素酶Dual-LUC实验的报告载体和效应载体DDual-LUC实验结果显示CsDOF5.8直接结合CsPrx25的启动子并激活其表达。在A、C和D中Pro25CsPrx25的1kb启动子Pro25MA中所示突变了预测结合位点的CsPrx251-kb启动子。02预测验证2024年5月扬州大学农学院刘巧泉和李钱峰课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“ABA-mediated regulation of rice grain quality and seed dormancy via the NF-YB1- SLRL2-bHLH144 Module”的研究论文。该文章揭示了植物激素脱落酸ABA通过“NF-YB1-SLRL2-bHLH144”全新分子模块协同调控水稻品质与种子休眠的机制。作者在寻找介导ABA调控Wx基因的转录因子时采用了一套“生物信息学初筛-表达谱复筛-时空表达定位”的严谨逻辑层层递进最终锁定了转录因子SLRL2。在进行数据库搜索之前作者先基于前期实验明确了两个必须满足的筛选条件即该转录因子的表达必须对ABA敏感并且与目标基因Wx在时空表达上高度协同。基于上述双重标准作者通过分析Rice FREND、RiceXPro和PlantTFDB三个数据库中所有转录因子在ABA处理下的表达变化以及与Wx基因的共表达系数初步筛选出了SLRL2和NF-YC9两个候选基因。接着为了验证数据库预测结果作者通过实时荧光定量PCRRT-qPCR检验发现SLRL2的表达确实被ABA强烈诱导且被ABA合成抑制剂显著抑制。而NF-YC9对ABA的响应非常微弱图7a-c。所以作者排除了NF-YC9将候选范围缩小至SLRL2。一个转录因子要调控种子中的Wx必须在种子发育期且在合成淀粉的组织中表达因此作者进一步分析了SLRL2的时空表达模式与组织定位。结果显示SLRL2与Wx在水稻发育的种子中具有完全一致的表达趋势图7d-fSLRL2的mRNA信号特异性分布在糊粉层和淀粉胚乳中图7g、h这正是Wx发挥作用合成直链淀粉的部位此外与SLRL2共表达的所有基因显著富集在“淀粉和蔗糖代谢”通路中图7i。作者锁定SLRL2为候选转录因子后通过DNA-蛋白互作等实验验证了SLRL2能直接结合Wx启动子上的CTCC motif直接抑制Wx表达。图7 检测SLRL2和NF-YC9对ABA响应情况以及时空表达模式与组织定位(Wang et al., 2024)。aSLRL2和NF-YC9在ABA或ABA合成抑制剂Fluridone处理下的表达情况bSLRL2和NF-YC9在短时间ABA处理下的表达情况。分别在50μM ABA处理前、处理后30分钟和60分钟采集水稻样品。在a、b中以OsUBCI作为内参基因归一化基因表达。未处理ABA或野生型对照样品中目标基因的表达水平设为1c采用双荧光素酶报告实验检测SLRL2对不同浓度ABA处理的响应d-fWxd、SLRL2e和NF-YC9f在水稻不同组织中的时空表达模式。以OsActin01为内参标准化基因表达。将基因在开花后5天5DAF的种子中的表达水平设为1。幼根YR和幼芽YS样品来自14日龄的水稻幼苗。茎、叶片、叶鞘和幼穗YP样品均来自孕穗期水稻。发育种子样品在0、5、10、15、20、25和30DAF收集g在5DAF的水稻种子中SLRL2的原位杂交分析。SE淀粉胚乳AL糊粉层PE果皮hSLRL2原位杂交的阴性对照iKEGG富集分析。2026年5月上海交通大学张才喜课题组联合云南农业大学段胜常课题组在Nature Communications杂志上发表了一篇题为“Pangenome and resequencing analyses reveal flowering evolution and genetic control inCerasus”的研究论文。该文章构建了首个覆盖17个物种、21个种质的樱属泛基因组揭示了PavAGL9受PavBPC6负调控并促进开花为樱桃开花期改良提供了关键基因资源。作者采用了“生物信息学预测表达模式相关性”的策略来寻找并验证PavAGL9的上游转录因子。首先利用植物转录因子预测数据库PlantRegMap以PavAGL9的启动子序列为诱饵作者预测出74个可能结合其启动子的候选转录因子。同时基于RNA-seq数据构建了加权基因共表达网络WGCNA图8。通过计算基因间的表达相关性发现74个候选转录因子中PavBPC6与PavAGL9的表达模式呈现出最强的相关性。因此PavBPC6被选定为最核心的上游候选调控因子。图8 WGCNA热图展示出高度相关的模块相关系数≥0.9与三个物种的花发育相关(Jiu et al., 2026)。灰色方块中包含该模块的基因数量紫色以及注释为花发育相关基因的子集数量蓝色。然后作者通过Y1H、EMSA、Dual-LUC证实了PavBPC6直接结合PavAGL9的启动子并抑制其转录活性图9a-e。作者在满足需冷量的甜樱桃花蕾中瞬时过表达PavBPC6。结果表明花蕾开花延迟且伴随PavAGL9表达量显著下调直接证明了该调控关系在樱桃原生组织中的生物学功能。图9 PavBPC6结合PavAGL9启动子抑制其转录并参与樱桃开花期的调控(Jiu et al., 2026)。aY1H实验证实PavBPC6与PavAGL9启动子结合bEMSA表明PavBPC6与含有motif的PavAGL9启动子片段相互作用cDual-LUC载体的示意图dDual-LUC实验显示PavBPC6抑制PavAGL9的转录e以LUC与REN的比值表示启动子活性。03启动子分段定位关键元件2023年6月中国农业科学院曹双河课题组联合西北农林科技大学宋喜悦课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Efficient proteome-wide identification of transcription factors targeting Glu-1: A case study for functional validation of TaB3-2A1 in wheat”的研究论文。该文章通过DNA Pull-down MS鉴定到了靶向小麦Glu-1启动子的转录因子TaB3-2A1并证实TaB3-2A1通过抑制储藏蛋白合成、促进淀粉积累及影响农艺性状。作者没有使用完整的启动子而是使用CCRM1-1位于起始密码子上游-208bp至-101bp进行了DNA Pull-down MS实验。CCRM1-1是作者团队在2019年发表的一项前期研究中通过系统分析并实验验证出的最关键的顺式调控模块。在前期的工作中作者首先通过生物信息学分析在Glu-1基因起始密码子上游1kb-1000bp至-1bp的启动子区域内识别出了30个保守的DNA motif图10。根据这些motif在启动子上的分布模式作者将这些区域划分为三个主要的保守顺式调控模块图10。图10Glu-1启动子中保守的顺式调控模块CCRMs。motif位置以起始密码子为参考点标示(Li et al., 2019)。在CCRM1中TOA、E-box和A-box分别与I-box、CCAAT和SEF4重叠。CCRM1可进一步分为两个亚模块CCRM1-1和CCRM1-2。为验证这些模块的功能作者构建了Glu-1启动子片段与GUS报告基因融合的pGUS300含CCRM1核心区、pGUS650含CCRM1CCRM2核心区和pGUS950含CCRM1CCRM2CCRM3核心区三个载体通过检测转基因小麦中GUS基因的表达情况来评估不同启动子片段的活性。实验结果表明CCRM2和CCRM3不影响表达特异性仅增强表达水平CCRM1核心区-300bp至-1bp已足以确保Glu-1基因在种子发育中精确的起始和时空表达模式图11。图11 携带pGUS300、pGUS650或pGUS950载体的转基因种子中的GUS染色情况和GUS相对表达量(Li et al., 2019)。a转基因种子发育过程中的GUS染色情况。自开花后5天5DAF起每5天收集一次种子b30DAF时种子中的GUS活性c发育种子中GUS报告基因的转录模式。转录水平以延伸因子1αeF1α为内参基因进行归一化。将CCRM1进一步细分构建pGUS208删除CCRM1-2保留CCRM1-1核心区和pGUS100仅包含核心区两个载体结果发现CCRM1-1-208bp至-101bp区域对于Glu-1基因的表达水平和表达特异性都至关重要图12。而CCRM1的另一部分CCRM1-2-300bp至-209bp则主要影响表达水平对特异性无影响图12。综上作者才从长达1kb的启动子序列中逐步缩小范围并最终确定了CCRM1-1这个仅108bp的关键调控区域。图12 携带pGUS100、pGUS208或pGUS300载体的转基因种子中的GUS染色情况和GUS相对表达量以及转基因小麦不同组织的GUS染色情况(Li et al., 2019)。a转基因种子的组织化学染色分析。自开花后5天5DAF起每5天收集一次种子b30DAF成熟种子中的GUS活性c发育期种子内的GUS基因表达量。相对表达量以延伸因子1αeF1α为内参基因进行归一化d携带pGUS100和pGUS208载体的转基因小麦不同组织的GUS染色。植物组织于开花两周后采集。作者以CCRM1-1为探针进行DNA Pull-down MS实验。通过比对小麦蛋白数据库从海量数据中筛选出被富集的蛋白质。再根据UniProt等数据库的注释从中剔除大量非特异性结合的代谢酶和激酶最终提取出31个转录因子涵盖B3、MYB、NAC等转录因子家族图13b。图13 鉴定结合于Glu-1启动子中CCRM1-1的转录因子(Xie et al., 2023)。a凝胶电泳及银染显示DNA pull-down实验中以CCRM1-1为探针所捕获的蛋白质。M蛋白质分子量Marker1带有CCRM1-1探针标记的磁珠捕获的蛋白质2未标记磁珠捕获的蛋白质b扇形图显示通过质谱鉴定到的与CCRM1-1结合的蛋白质组分。c使用PLACE数据库预测鉴定到的转录因子与CCRM1-1结合的motif。*表示具有与经典序列相似的motif。B3转录因子家族成员在种子发育中功能多样但具体调控Glu-1的机制尚不清晰作者发现B3转录因子家族中TaB3-2A1的表达量最高因此选择它作为该家族的代表性基因进行后续功能研究。Y1H、EMSA实验验证了TaB3-2A1与CCRM1-1的直接结合图14a、d。Dual-LUC实验证实TaB3-2A1能显著抑制由Glu-1启动子驱动的LUC报告基因活性确定其为转录抑制因子图14b、c。图14 TaB3‑2A1与CCRM1‑1结合的验证(Xie et al., 2023)。aY1H实验验证TaB3‑2A1与CCRM1‑1的结合b、cDual-LUC实验证实TaB3-2A1能显著抑制由Glu-1启动子驱动的LUC报告基因活性dEMSA验证TaB3‑2A1与CCRM1‑1在体外互作。小远叨叨总的来说Y1H筛库或DNA Pull-down MS筛不到转录因子往往是多种因素共同作用的结果。本文主要介绍了部分常见原因及相应的解决思路但实际实验中还有许多影响筛选结果的因素和应对策略。由于篇幅有限伯小远将在后续内容中继续为大家介绍。面对筛选结果不理想时与其反复重复相同的实验不如结合具体实验体系和研究目的灵活调整策略。不要让“筛不到”成为研究的终点ReferencesAlvarez J M, Schinke A L, Brooks M D, et al. 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