送样沟通中我们经常听到两个问题多个样本放在一起测数据会不会混明明已经提供了 Index为什么还要反复确认序列和方向其实这两个问题指向同一件事。高通量测序可以一次读取大量文库但测序仪并不知道每条序列属于哪个样本。真正负责“认人”的是建库时加上的 Index。可以把它想成行李托运牌不同乘客的行李可以进入同一套运输系统抵达后再按标签分流。标签贴对了行李各自回到主人手里标签内容或读取规则不一致就可能暂时找不到归属。一句话先说清Index 决定数据属于谁填写是否准确决定数据能否顺利拆分。样本上机前要先变成机器能读懂的“文库”测序仪真正接收的不是原始 DNA 或 RNA而是已经构建好的测序文库。简单理解文库就是许多待测 DNA 片段的集合每个片段两端都接上了特定接头才能被测序平台捕获、扩增和读取。接头中包含不同的功能区域P5/P7 帮助文库固定到芯片上Read 1/Read 2 区域提供测序起点Index 则标记样本身份。目标片段是我们真正想读取的内容接头负责让它能够上机、被读取、再被准确归类。图 1文库构建及接头结构示意。多个样本混在一起测完后怎么再分开建库时样本 A 连接 Index-1样本 B 连接 Index-2。两个文库完成质检后可以按照目标数据量混合到同一个测序池中这一步就是 Pooling。上机时测序仪同时读取目标片段和 Index。测序结束后拆样软件把读到的 Index 与样本表进行匹配匹配 Index-1 的数据归入样本 A匹配 Index-2 的数据归入样本 B。只有 Index 信息能够正确对应数据才能顺利“回家”。整个过程并不复杂加 Index → Pooling → 上机测序 → 读取 Index → 按样本拆分。一个标签够不够Single、Dual 和 UDI 的区别Single Index 只在 i7 位置使用一个 Index建库成本较低、操作也相对简单样本数量不多时较为常见。Dual Index 则同时使用 i7 和 i5相当于用两项信息共同确认身份可提供更多组合。UDI 是 Dual Index 中更严格的一种设计同一批测序样本里每个样本的 i7i5 组合都独一无二。这样一来因 Index hopping 产生的异常组合更容易被识别和过滤。需要提醒的是双 Index 不一定等于 UDI。选择试剂盒时应确认说明书是否明确标注 UDI并保存完整的 i7 和 i5 序列表。图 2UDI 序列示例每个样本对应一组 i5 与 i7。为什么换个平台原来的Index信息不能直接照抄Illumina、MGI 和 GeneMind 都可以完成高通量测序但它们使用的接头体系、模板制备方式和 Index 命名并不完全相同。平台文库与 Index 特点填写时重点确认Illumina常见Y 字形接头涉及 TruSeq、Nextera 等体系i7/i5 序列、读取长度及方向MGIBubble adapter通过滚环扩增形成 DNBBarcode1/Barcode2 与试剂表的对应关系GeneMind兼容Illumina 接头结构结合具体机型和上机要求确认这也是送样时最容易忽略的一点不要只写“Index 01”或“UDI 08”。编号只有放在具体试剂盒中才有意义。更稳妥的做法是同时提供试剂盒名称、Index 名称和真实碱基序列。Pooling 不是把几管文库随手倒在一起Pooling 是按照各样本所需的数据量把带有不同 Index 的文库精确混合成一管再共同上机。如果样本 A 需要的数据量更多它在混合池中的投入比例也会相应提高。实际项目还会涉及 Lane 和 Flow Cell。Lane 是芯片上的单条物理泳道Flow Cell 则是整张芯片。样本数量较少、数据需求明确时可以按 Lane 安排样本量大、需要更高整体效率时则可能按整张 Flow Cell 规划。无论采用哪一种Index 都是后续拆分的基础。真正容易出错的往往是送样表里的几个字段Illumina先分清 Single 还是 DualSingle Index 文库只需填写对应的 i7Dual Index 文库则需要同时提供 i7 和 i5。不要只对编号还要把样本名、真实序列和试剂盒中的引物信息放在一起核对。尤其是 i5应提前确认本次平台要求填写原始序列还是反向互补序列。真迈5000平台填写规则和NovaSeq1.5类似在填写i5端index时需要填写反向互补序列。图 3Illumina 单 Index 序列示例。图 4AIllumina 双 Index 结构与序列位置示例。图 4B样本表中的 i5/i7 信息核对示例。图 4CIndex 引物与试剂信息对应示例。MGI注意 Barcode1 与 Barcode2MGI 单端 Index 通常对应 Barcode1双端方案则需要同时确认 Barcode1 和 Barcode2。使用 NM344/NMB344 等试剂时应直接按照配套 UDI 表填写不能沿用 Illumina 的字段习惯。图 5MGI 单端 Index/Barcode 示例。图 6MGI 双端 UDIBarcode1 与 Barcode2 对照表。送样前建议按这个顺序核对第一步确认目标平台第二步确认文库类型和建库试剂盒第三步确认使用的是 Single、Dual 还是 UDI第四步逐个核对 i7/i5 或 Barcode1/Barcode2最后再检查序列方向和填写位置是否符合本次上机要求。自建文库建议同时提供试剂盒说明书和完整 Index 表。信息越完整技术人员越容易在上机前发现问题而不是等到拆样时再补救。图 7送样系统填写提示与信息表。 Index 怎么填才不出错？测序送样关键问题一次讲清
送样沟通中我们经常听到两个问题多个样本放在一起测数据会不会混明明已经提供了 Index为什么还要反复确认序列和方向其实这两个问题指向同一件事。高通量测序可以一次读取大量文库但测序仪并不知道每条序列属于哪个样本。真正负责“认人”的是建库时加上的 Index。可以把它想成行李托运牌不同乘客的行李可以进入同一套运输系统抵达后再按标签分流。标签贴对了行李各自回到主人手里标签内容或读取规则不一致就可能暂时找不到归属。一句话先说清Index 决定数据属于谁填写是否准确决定数据能否顺利拆分。样本上机前要先变成机器能读懂的“文库”测序仪真正接收的不是原始 DNA 或 RNA而是已经构建好的测序文库。简单理解文库就是许多待测 DNA 片段的集合每个片段两端都接上了特定接头才能被测序平台捕获、扩增和读取。接头中包含不同的功能区域P5/P7 帮助文库固定到芯片上Read 1/Read 2 区域提供测序起点Index 则标记样本身份。目标片段是我们真正想读取的内容接头负责让它能够上机、被读取、再被准确归类。图 1文库构建及接头结构示意。多个样本混在一起测完后怎么再分开建库时样本 A 连接 Index-1样本 B 连接 Index-2。两个文库完成质检后可以按照目标数据量混合到同一个测序池中这一步就是 Pooling。上机时测序仪同时读取目标片段和 Index。测序结束后拆样软件把读到的 Index 与样本表进行匹配匹配 Index-1 的数据归入样本 A匹配 Index-2 的数据归入样本 B。只有 Index 信息能够正确对应数据才能顺利“回家”。整个过程并不复杂加 Index → Pooling → 上机测序 → 读取 Index → 按样本拆分。一个标签够不够Single、Dual 和 UDI 的区别Single Index 只在 i7 位置使用一个 Index建库成本较低、操作也相对简单样本数量不多时较为常见。Dual Index 则同时使用 i7 和 i5相当于用两项信息共同确认身份可提供更多组合。UDI 是 Dual Index 中更严格的一种设计同一批测序样本里每个样本的 i7i5 组合都独一无二。这样一来因 Index hopping 产生的异常组合更容易被识别和过滤。需要提醒的是双 Index 不一定等于 UDI。选择试剂盒时应确认说明书是否明确标注 UDI并保存完整的 i7 和 i5 序列表。图 2UDI 序列示例每个样本对应一组 i5 与 i7。为什么换个平台原来的Index信息不能直接照抄Illumina、MGI 和 GeneMind 都可以完成高通量测序但它们使用的接头体系、模板制备方式和 Index 命名并不完全相同。平台文库与 Index 特点填写时重点确认Illumina常见Y 字形接头涉及 TruSeq、Nextera 等体系i7/i5 序列、读取长度及方向MGIBubble adapter通过滚环扩增形成 DNBBarcode1/Barcode2 与试剂表的对应关系GeneMind兼容Illumina 接头结构结合具体机型和上机要求确认这也是送样时最容易忽略的一点不要只写“Index 01”或“UDI 08”。编号只有放在具体试剂盒中才有意义。更稳妥的做法是同时提供试剂盒名称、Index 名称和真实碱基序列。Pooling 不是把几管文库随手倒在一起Pooling 是按照各样本所需的数据量把带有不同 Index 的文库精确混合成一管再共同上机。如果样本 A 需要的数据量更多它在混合池中的投入比例也会相应提高。实际项目还会涉及 Lane 和 Flow Cell。Lane 是芯片上的单条物理泳道Flow Cell 则是整张芯片。样本数量较少、数据需求明确时可以按 Lane 安排样本量大、需要更高整体效率时则可能按整张 Flow Cell 规划。无论采用哪一种Index 都是后续拆分的基础。真正容易出错的往往是送样表里的几个字段Illumina先分清 Single 还是 DualSingle Index 文库只需填写对应的 i7Dual Index 文库则需要同时提供 i7 和 i5。不要只对编号还要把样本名、真实序列和试剂盒中的引物信息放在一起核对。尤其是 i5应提前确认本次平台要求填写原始序列还是反向互补序列。真迈5000平台填写规则和NovaSeq1.5类似在填写i5端index时需要填写反向互补序列。图 3Illumina 单 Index 序列示例。图 4AIllumina 双 Index 结构与序列位置示例。图 4B样本表中的 i5/i7 信息核对示例。图 4CIndex 引物与试剂信息对应示例。MGI注意 Barcode1 与 Barcode2MGI 单端 Index 通常对应 Barcode1双端方案则需要同时确认 Barcode1 和 Barcode2。使用 NM344/NMB344 等试剂时应直接按照配套 UDI 表填写不能沿用 Illumina 的字段习惯。图 5MGI 单端 Index/Barcode 示例。图 6MGI 双端 UDIBarcode1 与 Barcode2 对照表。送样前建议按这个顺序核对第一步确认目标平台第二步确认文库类型和建库试剂盒第三步确认使用的是 Single、Dual 还是 UDI第四步逐个核对 i7/i5 或 Barcode1/Barcode2最后再检查序列方向和填写位置是否符合本次上机要求。自建文库建议同时提供试剂盒说明书和完整 Index 表。信息越完整技术人员越容易在上机前发现问题而不是等到拆样时再补救。图 7送样系统填写提示与信息表。