引言很多同学表示做药靶研究通过组学筛选到多个候选蛋白后不知道该如何合理的设计接下来的实验才能够在有限的经费下拿到尽可能全面的验证结果。很多研究者只做了一个Western blot验证表达差异或者补了一个siRNA敲低看表型就觉得“验证过了”。投稿的时候审稿人一句“target engagement证据不足”或者“缺乏遗传学因果验证”直接打回来。这篇文章我把文献里反复出现的验证逻辑整理成一个可操作的框架来给大家作为参考。维度一直接结合验证这是最基础也是最容易被跳过的一步。组学数据告诉你“这个蛋白可能是靶点”但直接结合是后续所有推论的前提。如果小分子和蛋白在试管里都不结合后面细胞里的效应大概率是脱靶或者间接效应。1.1 生物物理方法定量测亲和力▶ 纯化蛋白拿到手之后首选SPR表面等离子体共振或BLI生物层干涉可以实时拿到结合速率常数kon、解离速率常数koff和平衡解离常数KD。这两个方法的优势是不需要标记、样品消耗少、动力学信息完整。▶ ITC等温滴定量热法可以补充热力学信息ΔH、ΔS、结合计量比特别适合验证1:1结合还是多聚体结合。▶ MST微量热泳动则对膜蛋白和难纯化的蛋白更友好因为它在溶液中进行不需要固定。【设计要点】KD最好在μM级别以下如果是mM级别的弱结合要谨慎解释 —— 生理条件下可能根本达不到这个浓度。同时一定要做阴性对照蛋白同家族无关蛋白排除非特异性疏水结合。1.2 Pull down在复杂体系里验证富集生物物理方法用的是纯化蛋白而pull down用的是细胞裂解液更接近真实环境。把小分子生物素化后挂在链霉亲和素珠子上孵育裂解液然后用Western blot或质谱检测候选蛋白是否被富集。【关键对照】①游离小分子竞争对照加过量未标记小分子看信号是否消失②珠子生物素的空白对照排除珠子非特异吸附③失活类似物对照结构相近但无活性的化合物看是否还能拉下来。三个对照都过了pulldown结果才站得住。如果小分子不方便修饰比如修饰后活性丢失可以考虑光交联探针 —— 在分子上引入双吖丙啶或芳基叠氮基团UV照射后共价交联结合蛋白然后点击化学连上生物素做富集。维度二细胞内靶点结合验证试管里结合不代表细胞里也能结合。细胞膜通透性、细胞内浓度、蛋白翻译后修饰状态、蛋白相互作用网络都会影响实际的靶点结合。2.1 CETSA细胞热位移分析▶原理配体结合会稳定蛋白构象使其在加热时更难变性沉淀。把化合物处理过的细胞或裂解液做梯度升温离心取上清用Western blot或质谱检测可溶性靶蛋白的量绘制热熔曲线结合了药物的蛋白曲线会右移Tm升高。▶优势可以在完整活细胞里做保留了天然的细胞环境。后续发展的ITDRisothermal dose response格式可以在单一温度下做剂量梯度更适合高通量。【注意事项】不是所有蛋白结合后都会产生明显的热位移尤其是变构调节或者弱结合的情况。阴性结果不能直接排除结合需要用其他方法正交验证。另外加热可能导致蛋白聚集离心条件要优化好。2.2 DARTS药物亲和反应靶稳定性▶DARTS利用的是另一个原理配体结合会让蛋白对蛋白酶的敏感性下降。化合物和裂解液孵育后加入不同浓度的链霉蛋白酶或嗜热菌蛋白酶有限时间消化后检测剩余靶蛋白量。结合了药物的蛋白被保护条带更亮。▶优势是完全不需要修饰小分子而且操作简单普通实验室就能做。缺点是蛋白酶消化条件需要仔细摸索而且对低丰度蛋白不友好。2.3 LiP-MS有限水解-质谱蛋白质组级别的靶点结合如果想在全蛋白质组层面看哪些蛋白发生了构象变化LiP-MSlimited proteolysis-coupled mass spectrometry是目前最 powerful 的方法。用蛋白酶K做有限时间的非特异性水解结合了小分子的蛋白会在切割位点上产生差异肽段然后用定量质谱DIA或TMT检测。LiP-MS不仅能告诉你“哪个蛋白结合了”还能通过差异肽段的位置大致定位结合区域。Picotti实验室2016年在Nature Biotechnology上的方法学论文是必读的。但这个方法对质谱仪和数据分析能力要求较高。维度三功能调控验证结合了但不改变功能那这个结合可能没有生物学意义。这一步要验证的是小分子结合靶点后是否确实调控了靶点的生化活性或下游信号3.1 酶活/功能实验▶ 如果靶点是酶就做酶活实验。激酶测磷酸化底物的速率磷酸酶测去磷酸化蛋白酶测底物切割GTPase测GTP水解。用荧光底物或显色底物做剂量反应曲线拿到IC50或EC50。▶ 如果靶点不是酶比如支架蛋白、转录因子、受体就要找对应的功能转录因子做报告基因实验受体做下游信号磷酸化检测蛋白-蛋白相互作用做Co-IP。3.2 下游通路验证磷酸化组和转录组单个靶点的功能改变会传导到下游通路。用磷酸化蛋白质组学可以全局看激酶/磷酸酶底物的变化用RNA-seq看转录水平的响应。这两个组学方法不仅能验证“靶点确实被调控了”还能发现之前没预料到的旁路激活或反馈回路。【实验设计建议】做时间梯度而不是只取一个时间点。早期分钟级的磷酸化变化更可能是直接靶点效应晚期小时级的转录变化更多是下游级联反应。同时做剂量梯度确保效应是剂量依赖的。数据分析时激酶活性推断可以帮你判断上游是哪个激酶被调控了和你的候选靶点是否一致。3.3 近端药效学标志物找到一个能直接反映靶点调控状态的标志物非常重要。比如靶点是激酶就看它自身磷酸化位点或已知底物的磷酸化水平靶点是E3连接酶就看底物蛋白的降解。这个PD biomarker在后续细胞实验和动物实验中都会反复用到是连接“靶点结合”和“表型效应”的桥梁。维度四遗传学因果验证这是整个验证链条中最有说服力、也最容易被忽略的一环。药理学抑制有效果不代表就是通过这个靶点起作用的 —— 小分子可能有脱靶。只有遗传学操作能建立因果关系。4.1 基因敲除/敲低靶点必要性验证用CRISPR-Cas9敲除候选基因或者用siRNA/shRNA敲低表达然后看小分子是否还能产生表型。如果敲除后药物效应消失或显著减弱说明这个靶点是药物作用所必需的。关键对照① 至少用2-3条独立的sgRNA或siRNA排除off-target效应② CRISPR和RNAi两种方法最好都做因为它们的脱靶谱不同一致的结果更可信③ 在多个细胞系中重复特别是不同组织来源或不同遗传背景的细胞系。4.2 Rescue实验靶点充分性验证敲除后再回补野生型基因cDNA rescue如果表型恢复基本可以锁定因果关系。更严谨的做法是回补“药物不敏感突变体” —— 把小分子结合位点的关键氨基酸突变掉让蛋白保留正常功能但不再结合药物。如果回补野生型能rescue、回补结合位点突变体不能rescue那证据就非常硬了。这个策略在激酶领域很常用比如gatekeeper突变就是经典的药物抗性突变反过来也可以用来验证靶点特异性。4.3 过表达和组成型激活/失活突变过表达靶点蛋白看是否增强药物敏感性或者引入组成型激活突变看是否模拟药物效应这些都是辅助验证手段。但要注意过表达可能导致非生理水平的蛋白相互作用结果需要谨慎解读。维度五表型与体内验证——证明“在生理环境下有效”细胞层面验证完了最终还是要回到组织和动物层面。这一步要回答在更复杂的生物体系里靶点调控是否能产生预期的治疗效果5.1 细胞表型实验根据研究领域选择合适的表型▶ 肿瘤细胞做增殖、凋亡、迁移侵袭▶ 免疫细胞做细胞因子分泌、吞噬、极化▶ 神经元做突触形成、电生理。关键是要把表型和靶点调控关联起来 —— 用前面找到的PD biomarker做同步检测证明“表型出现时靶点确实被调控了”。5.2 类器官和原代细胞肿瘤细胞系传代太多遗传背景已经偏离原始肿瘤。类器官和患者来源原代细胞更能反映真实的疾病状态在这些模型里验证靶点效应说服力更强。当然培养难度和成本也更高。5.3 动物模型靶点参与度疗效动物实验分两个层次▶ 第一层是靶点参与度给药后取组织做CETSA或检测PD biomarker证明药物在体内确实到达了靶组织并结合了靶点▶ 第二层是疗效看疾病表型是否改善。【实验设计要点】① 药代动力学PK和药效动力学PD要关联起来知道什么时间点靶点占据率最高② 做剂量梯度找到最低有效剂量③ 如果有条件用基因工程小鼠GEMM而不是裸鼠移植瘤免疫完整的模型更能反映真实情况④ 安全性指标不能省体重、血液生化、主要脏器HE染色都要做。5.4 体内遗传学验证如果条件允许在动物层面也做遗传学验证 —— 条件性敲除小鼠、AAV介导的组织特异性敲低、或者反义寡核苷酸ASO。体内遗传学证据药理学证据双管齐下是靶点验证的“金标准”组合。维度六探针质量与对照设计前面五个维度的实验都依赖一个前提你用的小分子是靠谱的化学探针。如果探针本身选择性差、有细胞毒性、或者在培养基里不稳定那所有实验结果都不可信。6.1 高质量化学探针的标准结构基因组学联盟SGC和Chemical Probes Portal提出的探针质量标准我整理了核心指标6.2 必须设置的对照做任何小分子实验以下对照缺一不可• 溶剂对照DMSO或相应溶剂排除溶剂本身的影响DMSO终浓度最好不超过0.1%。• 结构相近的失活类似物最理想的阴性对照只改关键相互作用位点保留骨架和理化性质。• 不同骨架的正交探针两个化学结构完全不同但靶向同一蛋白的化合物如果产生相同表型可信度大大提高。• 已知阳性药物如果靶点有上市药物或文献报道的工具化合物用它做阳性对照验证你的实验体系是否正常。• 细胞活力平行检测排除表型是因为细胞毒性导致的假象特别是做增殖、凋亡实验时。验证优先级与时间线建议六个维度全做一遍可能要半年以上实际课题中需要根据研究阶段和资源合理分配优先级。我一般按这个顺序推进第一阶段快速验证排除假阳性• 直接结合SPR/BLI测K_D pulldown验证富集• 细胞内结合CETSAWB读out快速确认• 功能验证酶活实验或PD biomarker检测• 遗传学初筛siRNA敲低看表型是否消失第二阶段建立因果关系• CRISPR敲除 cDNA rescue• 结合位点突变体验证• 磷酸化组/转录组看下游通路• 多细胞系重复验证第三阶段体内验证和转化• 类器官/原代细胞验证• 动物模型PK/PD和疗效• 体内遗传学验证如有条件• 探针选择性谱化学蛋白质组学或激酶谱筛选当然这个时间线不是绝对的。如果你的候选靶点有现成的高质量探针和基因工程小鼠进度可以大大加快如果是全新靶点、蛋白难纯化、又没有动物模型那每个环节都可能卡住。结语靶点验证本质上是一个“排除其他可能性”的过程。每多一个维度的正交证据就多排除一种替代解释结论的可信度就上一个台阶。组学筛选给了你一个候选名单而验证实验决定了这个候选能不能变成一个真正的靶点、一篇好文章、或者一个新药项目的起点。希望这个框架对你的课题设计有帮助。参考文献与延伸阅读1. Molina DM, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 2013;341(6141):84-87.2. Lomenick B, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(51):21984-21989.3. Feng Y, et al. Limited proteolysis-coupled mass spectrometry for the detection of protein-ligand interactions. Nat Protoc. 2022;17(10):2315-2340.4. Savitski MM, et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 2014;346(6205):1255784.5. Arrowsmith CH, et al. The promise and peril of chemical probes. Nat Chem Biol. 2015;11(8):536-541.6. Schenone M, et al. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 2013;9(4):232-240. 小分子靶点验证技术有哪些？该如何设计实验？
引言很多同学表示做药靶研究通过组学筛选到多个候选蛋白后不知道该如何合理的设计接下来的实验才能够在有限的经费下拿到尽可能全面的验证结果。很多研究者只做了一个Western blot验证表达差异或者补了一个siRNA敲低看表型就觉得“验证过了”。投稿的时候审稿人一句“target engagement证据不足”或者“缺乏遗传学因果验证”直接打回来。这篇文章我把文献里反复出现的验证逻辑整理成一个可操作的框架来给大家作为参考。维度一直接结合验证这是最基础也是最容易被跳过的一步。组学数据告诉你“这个蛋白可能是靶点”但直接结合是后续所有推论的前提。如果小分子和蛋白在试管里都不结合后面细胞里的效应大概率是脱靶或者间接效应。1.1 生物物理方法定量测亲和力▶ 纯化蛋白拿到手之后首选SPR表面等离子体共振或BLI生物层干涉可以实时拿到结合速率常数kon、解离速率常数koff和平衡解离常数KD。这两个方法的优势是不需要标记、样品消耗少、动力学信息完整。▶ ITC等温滴定量热法可以补充热力学信息ΔH、ΔS、结合计量比特别适合验证1:1结合还是多聚体结合。▶ MST微量热泳动则对膜蛋白和难纯化的蛋白更友好因为它在溶液中进行不需要固定。【设计要点】KD最好在μM级别以下如果是mM级别的弱结合要谨慎解释 —— 生理条件下可能根本达不到这个浓度。同时一定要做阴性对照蛋白同家族无关蛋白排除非特异性疏水结合。1.2 Pull down在复杂体系里验证富集生物物理方法用的是纯化蛋白而pull down用的是细胞裂解液更接近真实环境。把小分子生物素化后挂在链霉亲和素珠子上孵育裂解液然后用Western blot或质谱检测候选蛋白是否被富集。【关键对照】①游离小分子竞争对照加过量未标记小分子看信号是否消失②珠子生物素的空白对照排除珠子非特异吸附③失活类似物对照结构相近但无活性的化合物看是否还能拉下来。三个对照都过了pulldown结果才站得住。如果小分子不方便修饰比如修饰后活性丢失可以考虑光交联探针 —— 在分子上引入双吖丙啶或芳基叠氮基团UV照射后共价交联结合蛋白然后点击化学连上生物素做富集。维度二细胞内靶点结合验证试管里结合不代表细胞里也能结合。细胞膜通透性、细胞内浓度、蛋白翻译后修饰状态、蛋白相互作用网络都会影响实际的靶点结合。2.1 CETSA细胞热位移分析▶原理配体结合会稳定蛋白构象使其在加热时更难变性沉淀。把化合物处理过的细胞或裂解液做梯度升温离心取上清用Western blot或质谱检测可溶性靶蛋白的量绘制热熔曲线结合了药物的蛋白曲线会右移Tm升高。▶优势可以在完整活细胞里做保留了天然的细胞环境。后续发展的ITDRisothermal dose response格式可以在单一温度下做剂量梯度更适合高通量。【注意事项】不是所有蛋白结合后都会产生明显的热位移尤其是变构调节或者弱结合的情况。阴性结果不能直接排除结合需要用其他方法正交验证。另外加热可能导致蛋白聚集离心条件要优化好。2.2 DARTS药物亲和反应靶稳定性▶DARTS利用的是另一个原理配体结合会让蛋白对蛋白酶的敏感性下降。化合物和裂解液孵育后加入不同浓度的链霉蛋白酶或嗜热菌蛋白酶有限时间消化后检测剩余靶蛋白量。结合了药物的蛋白被保护条带更亮。▶优势是完全不需要修饰小分子而且操作简单普通实验室就能做。缺点是蛋白酶消化条件需要仔细摸索而且对低丰度蛋白不友好。2.3 LiP-MS有限水解-质谱蛋白质组级别的靶点结合如果想在全蛋白质组层面看哪些蛋白发生了构象变化LiP-MSlimited proteolysis-coupled mass spectrometry是目前最 powerful 的方法。用蛋白酶K做有限时间的非特异性水解结合了小分子的蛋白会在切割位点上产生差异肽段然后用定量质谱DIA或TMT检测。LiP-MS不仅能告诉你“哪个蛋白结合了”还能通过差异肽段的位置大致定位结合区域。Picotti实验室2016年在Nature Biotechnology上的方法学论文是必读的。但这个方法对质谱仪和数据分析能力要求较高。维度三功能调控验证结合了但不改变功能那这个结合可能没有生物学意义。这一步要验证的是小分子结合靶点后是否确实调控了靶点的生化活性或下游信号3.1 酶活/功能实验▶ 如果靶点是酶就做酶活实验。激酶测磷酸化底物的速率磷酸酶测去磷酸化蛋白酶测底物切割GTPase测GTP水解。用荧光底物或显色底物做剂量反应曲线拿到IC50或EC50。▶ 如果靶点不是酶比如支架蛋白、转录因子、受体就要找对应的功能转录因子做报告基因实验受体做下游信号磷酸化检测蛋白-蛋白相互作用做Co-IP。3.2 下游通路验证磷酸化组和转录组单个靶点的功能改变会传导到下游通路。用磷酸化蛋白质组学可以全局看激酶/磷酸酶底物的变化用RNA-seq看转录水平的响应。这两个组学方法不仅能验证“靶点确实被调控了”还能发现之前没预料到的旁路激活或反馈回路。【实验设计建议】做时间梯度而不是只取一个时间点。早期分钟级的磷酸化变化更可能是直接靶点效应晚期小时级的转录变化更多是下游级联反应。同时做剂量梯度确保效应是剂量依赖的。数据分析时激酶活性推断可以帮你判断上游是哪个激酶被调控了和你的候选靶点是否一致。3.3 近端药效学标志物找到一个能直接反映靶点调控状态的标志物非常重要。比如靶点是激酶就看它自身磷酸化位点或已知底物的磷酸化水平靶点是E3连接酶就看底物蛋白的降解。这个PD biomarker在后续细胞实验和动物实验中都会反复用到是连接“靶点结合”和“表型效应”的桥梁。维度四遗传学因果验证这是整个验证链条中最有说服力、也最容易被忽略的一环。药理学抑制有效果不代表就是通过这个靶点起作用的 —— 小分子可能有脱靶。只有遗传学操作能建立因果关系。4.1 基因敲除/敲低靶点必要性验证用CRISPR-Cas9敲除候选基因或者用siRNA/shRNA敲低表达然后看小分子是否还能产生表型。如果敲除后药物效应消失或显著减弱说明这个靶点是药物作用所必需的。关键对照① 至少用2-3条独立的sgRNA或siRNA排除off-target效应② CRISPR和RNAi两种方法最好都做因为它们的脱靶谱不同一致的结果更可信③ 在多个细胞系中重复特别是不同组织来源或不同遗传背景的细胞系。4.2 Rescue实验靶点充分性验证敲除后再回补野生型基因cDNA rescue如果表型恢复基本可以锁定因果关系。更严谨的做法是回补“药物不敏感突变体” —— 把小分子结合位点的关键氨基酸突变掉让蛋白保留正常功能但不再结合药物。如果回补野生型能rescue、回补结合位点突变体不能rescue那证据就非常硬了。这个策略在激酶领域很常用比如gatekeeper突变就是经典的药物抗性突变反过来也可以用来验证靶点特异性。4.3 过表达和组成型激活/失活突变过表达靶点蛋白看是否增强药物敏感性或者引入组成型激活突变看是否模拟药物效应这些都是辅助验证手段。但要注意过表达可能导致非生理水平的蛋白相互作用结果需要谨慎解读。维度五表型与体内验证——证明“在生理环境下有效”细胞层面验证完了最终还是要回到组织和动物层面。这一步要回答在更复杂的生物体系里靶点调控是否能产生预期的治疗效果5.1 细胞表型实验根据研究领域选择合适的表型▶ 肿瘤细胞做增殖、凋亡、迁移侵袭▶ 免疫细胞做细胞因子分泌、吞噬、极化▶ 神经元做突触形成、电生理。关键是要把表型和靶点调控关联起来 —— 用前面找到的PD biomarker做同步检测证明“表型出现时靶点确实被调控了”。5.2 类器官和原代细胞肿瘤细胞系传代太多遗传背景已经偏离原始肿瘤。类器官和患者来源原代细胞更能反映真实的疾病状态在这些模型里验证靶点效应说服力更强。当然培养难度和成本也更高。5.3 动物模型靶点参与度疗效动物实验分两个层次▶ 第一层是靶点参与度给药后取组织做CETSA或检测PD biomarker证明药物在体内确实到达了靶组织并结合了靶点▶ 第二层是疗效看疾病表型是否改善。【实验设计要点】① 药代动力学PK和药效动力学PD要关联起来知道什么时间点靶点占据率最高② 做剂量梯度找到最低有效剂量③ 如果有条件用基因工程小鼠GEMM而不是裸鼠移植瘤免疫完整的模型更能反映真实情况④ 安全性指标不能省体重、血液生化、主要脏器HE染色都要做。5.4 体内遗传学验证如果条件允许在动物层面也做遗传学验证 —— 条件性敲除小鼠、AAV介导的组织特异性敲低、或者反义寡核苷酸ASO。体内遗传学证据药理学证据双管齐下是靶点验证的“金标准”组合。维度六探针质量与对照设计前面五个维度的实验都依赖一个前提你用的小分子是靠谱的化学探针。如果探针本身选择性差、有细胞毒性、或者在培养基里不稳定那所有实验结果都不可信。6.1 高质量化学探针的标准结构基因组学联盟SGC和Chemical Probes Portal提出的探针质量标准我整理了核心指标6.2 必须设置的对照做任何小分子实验以下对照缺一不可• 溶剂对照DMSO或相应溶剂排除溶剂本身的影响DMSO终浓度最好不超过0.1%。• 结构相近的失活类似物最理想的阴性对照只改关键相互作用位点保留骨架和理化性质。• 不同骨架的正交探针两个化学结构完全不同但靶向同一蛋白的化合物如果产生相同表型可信度大大提高。• 已知阳性药物如果靶点有上市药物或文献报道的工具化合物用它做阳性对照验证你的实验体系是否正常。• 细胞活力平行检测排除表型是因为细胞毒性导致的假象特别是做增殖、凋亡实验时。验证优先级与时间线建议六个维度全做一遍可能要半年以上实际课题中需要根据研究阶段和资源合理分配优先级。我一般按这个顺序推进第一阶段快速验证排除假阳性• 直接结合SPR/BLI测K_D pulldown验证富集• 细胞内结合CETSAWB读out快速确认• 功能验证酶活实验或PD biomarker检测• 遗传学初筛siRNA敲低看表型是否消失第二阶段建立因果关系• CRISPR敲除 cDNA rescue• 结合位点突变体验证• 磷酸化组/转录组看下游通路• 多细胞系重复验证第三阶段体内验证和转化• 类器官/原代细胞验证• 动物模型PK/PD和疗效• 体内遗传学验证如有条件• 探针选择性谱化学蛋白质组学或激酶谱筛选当然这个时间线不是绝对的。如果你的候选靶点有现成的高质量探针和基因工程小鼠进度可以大大加快如果是全新靶点、蛋白难纯化、又没有动物模型那每个环节都可能卡住。结语靶点验证本质上是一个“排除其他可能性”的过程。每多一个维度的正交证据就多排除一种替代解释结论的可信度就上一个台阶。组学筛选给了你一个候选名单而验证实验决定了这个候选能不能变成一个真正的靶点、一篇好文章、或者一个新药项目的起点。希望这个框架对你的课题设计有帮助。参考文献与延伸阅读1. Molina DM, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 2013;341(6141):84-87.2. Lomenick B, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(51):21984-21989.3. Feng Y, et al. Limited proteolysis-coupled mass spectrometry for the detection of protein-ligand interactions. Nat Protoc. 2022;17(10):2315-2340.4. Savitski MM, et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 2014;346(6205):1255784.5. Arrowsmith CH, et al. The promise and peril of chemical probes. Nat Chem Biol. 2015;11(8):536-541.6. Schenone M, et al. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 2013;9(4):232-240.